纳米银的制备方法及对小麦赤霉病菌抗菌活性的影响（二）
2结果与分析
2.1纳米银的制备与表征
利用化学还原法制备纳米银，纳米银溶液颜色呈亮黄色。纳米银在400 nm左右出现了很强的吸收峰(图1A)，这是典型的10−20 nm纳米银的紫外特征吸收峰。进一步通过TEM表征，纳米银为类似球形、粒径为5−30 nm的颗粒(图1B)。
图1纳米银粒子的UV-vis吸收光谱图(A)及TEM图(B)
2.2纳米银的抑菌活性
纳米银对小麦赤霉病菌的抑制效果见表1。结果表明，纳米银能抑制病原真菌的生长，抑制率随着浓度的增加而增大。其中，10μg/mL的纳米银对小麦赤霉病菌抑制率高达93.9%，说明病原真菌对纳米银的敏感性很强。对各处理间的不同浓度进行方差分析和Duncan检验，结果表明，病原真菌的各处理间差异达到极显著水平(<0.01)。
纳米银对病原真菌的毒力回归方程为=1.256+5.289 2，50为0.59μg/mL，2为0.975 5。可见，纳米银对小麦赤霉病菌的抑制作用比较强。病原真菌的毒力回归方程的相关系数2大于0.9，说明其曲线与实际拟合程度相当好。
2.3纳米银对菌体内保护酶活性的影响
2.3.1纳米银处理时间对超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响：随着纳米银处理时间的延长，SOD酶活出现先升高后下降的变化趋势。SOD酶活从2 h开始迅速上升，4 h的酶活达到最大，是对照组的5.20倍，随着时间的推移，活性开始下降，10 h的酶活最低，为对照组的63.12%(图2)。方差分析表明，SOD酶活性对纳米银相对敏感，随着处理时间的不同，受纳米银的影响存在着显著性差异。
图2纳米银处理时间对SOD活性的影响
2.3.2纳米银处理时间对过氧化物酶(POD)活性的影响：POD对照组活性与SOD对照组表现出相似的变化情况，随着处理时间的增加不断升高。处理组的POD活性随着时间的延长同样呈现先升高后下降的趋势，在4 h达到最大值，为对照组的1.05倍，与SOD活性最高值出现在4 h相同，在10 h达到最小值，为对照组的14.85%(图3)。2、4、6、8、10 h各处理组POD活性相比差异显著。
2.3.3纳米银处理时间对过氧化氢酶(CAT)活性的影响：对照组CAT酶活在试验时间内，呈上升趋势，纳米银对小麦赤霉病菌的CAT酶活性出现先升高后下降的变化，与SOD、POD活性呈现出相似的变化趋势，4 h的CAT酶活出现最大值，处理组的CAT活性一直低于对照组(图4)。与其他处理时间的活性相比差异显著。
图3纳米银处理时间对POD活性的影响
图4纳米银处理时间对CAT活性的影响
2.4纳米银对菌体内MDA含量的影响
处理组MDA含量呈现先升高后降低的趋势，在6 h时，迅速上升至最高值1.40 nmol/g，为对照组的2.41倍，6 h后开始出现下降趋势，10 h降至最低，为对照组的1.05倍。对照组在2−10 h，呈现平缓的上升趋势，10 h出现最大值，但始终低于处理组(图5)。
图5纳米银处理时间对MDA含量的影响
2.5纳米银对菌体内电导率的影响
随着处理时间的推移，纳米银处理后的小麦赤霉病菌溶液的导电率2−6 h之内呈现上升趋势，6 h出现最大值，为对照组的1.09倍，6 h之后，导电率开始下降，10 h出现最小值，为对照组的98.89%。细胞膜一旦受到破坏，膜透性就会增大，从而使细胞内的电解质外渗。上述结果说明，经纳米银处理后，小麦赤霉病菌的细胞膜受到破坏，随着处理时间的增长，菌体膜的完整性丧失，电解质出现外渗，电导率最终出现下降的现象(图6)。
图6纳米银处理时间对电导率含量的影响
2.6纳米银对菌体内可溶性蛋白含量的影响
纳米银处理组和对照组的可溶性蛋白含量均呈现降低的趋势。处理组蛋白含量随着时间的延长不断降低，在10 h出现最低值，为1.27 mg/g，是对照组的56.69%。对照组蛋白含量在开始时也出现降低的情况，但始终高于处理组，且降低速率低于处理组(图7)。
图7纳米银处理时间对蛋白含量的影响
2.7纳米银对菌体内可溶性糖含量的影响
纳米银各处理组和对照组的可溶性糖含量及可溶性蛋白含量呈现同样的降低现象。处理组糖含量随着时间的增加不断降低，6 h到10 h下降缓慢，在10 h出现最低值，为0.40 mg/g，是对照组的92%。对照组在整个实验过程中与处理组趋势接近，但含量始终高于处理组(图8)。
图8纳米银处理时间对糖含量的影响
3讨论
纳米银能显著抑制小麦赤霉病菌的生长，50为0.59μg/mL。纳米银的抑制作用与其浓度成正比，随着浓度的增大而增大。10μg/mL纳米银的抑菌率达到93.9%。Zhao等合成了一种新型的10-Hydroxycanthin-6-one抗菌剂，表明其对小麦赤霉病菌有很强的抑制活性，50μg/mL的10-Hydroxycanthin-6-one酯类衍生物7s(10-hydroxycanthin-6-one R=CH3CH3)化合物能完全抑制病原菌的生长，10-meoxycanthin-6-one、10-Hydroxycanthin-6-one酯类衍生物7s(10-Hydroxycanthin-6-one R=CH3)和7t(10-Hydroxycanthin-6-one R=CH3CH2)化合物的最小抑菌浓度在3.91μg/mL到31.25μg/mL之间。陆云等研究了4种杀菌剂(氟环唑、己唑醇、甲基硫菌灵和南宁霉素毒立)对小麦赤霉病菌的抑制作用，发现氟环唑和己唑醇对病原真菌的抑制效果最好，其50分别是0.201 5μg/mL和0.235 6μg/mL；其次是甲基硫菌灵，50是5.115 7μg/mL；南宁霉素毒力最弱，其50是389.313 24μg/mL。因此，纳米银较一些杀菌剂有相当或更好的抑菌效果，有望成为一种新型纳米杀菌剂。
纳米银处理小麦赤霉病菌2−10 h，菌体内SOD、POD和CAT的活性随着处理时间的延长均呈现先上升后下降的趋势，在4 h达到最高值。结果表明，纳米银在抑菌过程中，影响了菌体内3种酶的活性。原因可能是随着胁迫程度的增强，氧自由基不断积累，为了适应环境，增强本身对胁迫的抵御能力，菌体的酶促系统中SOD、POD、CAT等活性也会相应发生变化，这是正常生理性抗逆反应。然而菌体细胞在抵御过程中受到了破坏，所以酶的活性出现下降，细胞濒临死亡，从而造成菌体的生长受到抑制。通过研究纳米银对3种保护酶活性的影响，得出破坏病原菌的膜保护系统是纳米银抑菌的机制之一。
有研究认为，正常情况下细胞中SOD、POD和CAT 3种保护酶协调一致，可以防止过多自由基造成的细胞毒害，一旦细胞内自由基所处动态平衡被破坏，细胞就有可能受到损伤。当细胞受到外界刺激时，SOD能够嵌入到线粒体基质中，防止细胞中产生过量的活性氧。CAT能够防止体内过多H2O2的产生，降低细胞发生氧化的可能性。POD能催化其他物质的同时，将H2O2还原为H2O。SOD、POD和CAT作为生物体内重要的抗氧化酶类，能够降低对细胞膜起损伤作用的活性氧自由基，防止细胞受到破坏。由此可知，当病原真菌受到纳米银的刺激时，会产生一系列的防御反应，当细胞内活性氧的生成能力超过其清除能力，导致3种保护酶的活性出现暂时升高的现象，但因活性氧自由基的不断增多，导致细胞受到破坏，进一步抑制菌体的生长，使3种酶的活力开始逐渐下降。高橼等研究了月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌3种酶活性的影响，发现了同样的变化趋势。魏立强等研究了旱芹粗提物对棉花枯萎病菌保护酶活性的影响，结果表明，随着纳米银处理时间的增加，菌体内的SOD、POD和CAT活性同样出现先上升后下降的变化趋势。因此，病原真菌体内3种保护酶系统的活性被破坏，损害活性氧自由基清除系统，导致细胞膜系统的完整性严重损伤，从而使菌体受到一定程度的破坏。
小麦赤霉病菌经纳米银处理后，病原菌的可溶性蛋白和糖含量降低，病原菌MDA含量和电导率出现先升高后下降的趋势。计红芳等研究绒白乳菇发酵液提取物对杨树叶枯病菌MDA含量的影响，发现同样的变化趋势。随着纳米银处理时间的增加，小麦赤霉病菌细胞膜受到破坏，蛋白质的结构出现水解和变性，膜结构的破坏，使得MDA不断积累，从而出现升高趋势，电导率由于电解质外渗，同样出现升高的现象。电导率升高，表明菌丝体浸出液压力增加，可能是浸出液中存在渗漏的内含物，而渗漏是由于菌丝细胞膜透性遭到了破坏。随着菌体脂质过氧化程度的加剧，细胞膜的完整性丧失，进一步使得MDA和电导率出现下降趋势。纳米银可以显著抑制病原菌的活性，说明该物质可以严重破坏病原菌的抗氧化系统，使得蛋白质和糖类水解，进而使细胞膜系统受到损伤，细胞渗透性加强，最终导致细胞死亡。通过研究纳米银对小麦赤霉病菌保护酶活性的影响，为纳米银抗真菌机理以及抑菌应用提供理论依据，为防治植物真菌病害提供参考。为了进一步了解纳米银对真菌的抑菌机理，仍需要进行分子水平上的研究。
4结论
纳米银能显著抑制小麦赤霉病菌的生长，抑制作用随着浓度的增加而不断增大，10μg/mL的纳米银对病原菌的抑制率达90%以上，50为0.59μg/mL。
随着纳米银处理时间的增长，3种酶的活性均出现先增加后降低的变化。SOD、POD、CAT均在4 h出现最高值，10 h降至最低。纳米银提高菌体内丙二醛含量，降低可溶性蛋白和可溶性糖含量。