焦化污染场地中萘降解菌株AO-4鉴定、生长、降解机理及环境条件带来的影响（二）
1材料和方法
1.1实验材料及仪器
1.1.1土壤样品的采集
供试土壤采集于山西省某煤焦化工污染场地，随机采集多个取样点的表层（0～10cm）土壤，将采集到的土壤样品用2mm土壤筛进行筛分，剔除杂质。充分混匀后，于4℃冰箱中保存。
1.1.2化学试剂
本研究所使用的主要药品：萘、芴、菲等PAHs（纯度大于97%，美国Aladdin公司）；甲醇、乙酸乙酯等有机试剂（色谱纯，美国Fisher Chemical公司）；蛋白胨等非有机试剂（分析纯，上海生工生物工程公司化学试剂）。
1.1.3实验仪器
BCV-1FD超净工作台（上海一恒科学仪器有限公司）、LRH生化培养箱（上海一恒科技有限公司）、Agilent 1260型高效液相色谱仪（安捷伦科技（中国）有限公司）、THZ-C恒温振荡培养箱（苏州培英实验设备有限公司）、LS-50H立式压力蒸汽灭菌锅（江阴滨江医疗设备有限公司）、UV8000S紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司）、KH20R高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、Nikon YS100生物显微镜[奥林巴斯（中国）有限公司]、SC850全自动凝胶成像系统（上海山富科学仪器有限公司）、veriti96 PCR仪（赛默飞世尔科技有限公司）。
1.2实验方法
1.2.1试剂配置
实验用培养基包括LB培养基和MSM无机盐培养基，配方如下。
LB养基：蛋白胨10.00g/L，酵母膏10.00g/L，NaCl 5.00g/L，pH=7.2。
MSM无机盐培养基：K2HPO4·3H2O 4.25g/L，NaH2PO4·H2O 1.00g/L，NH4Cl 2.00g/L，MgSO4·7H2O 0.20g/L，FeSO4·7H2O 0.012g/L，MnSO4·H2O 0.003g/L，ZnSO4·7H2O 0.003g/L，CoSO4·7H2O 0.001g/L，pH=7.0～7.2。
配置时按以上浓度称量，用蒸馏水定容至1000mL，固体培养基配方在此基础上加15g/L琼脂，在121℃、0.103MPa条件下灭菌20min。
PAHs的配置：用丙酮作为溶剂配制萘（浓度为100g/L）、芴、菲、蒽、芘（浓度分别为5g/L）的溶液，通过无菌有机滤头（孔径0.22μm）过滤除菌，按所需浓度添加到降解体系中后，待丙酮挥发完毕使用。
1.2.2萘降解菌的筛选
取10g污染土壤加入到90mL无菌水中，于温度30℃、转速130r/min条件下浸取5h，静置30min后，取5mL上清液加入到45mL以萘（100mg/L）为唯一碳源的萘选择性液体MSM培养基中，在30℃、130r/min的恒温振荡培养箱中避光培养7d，然后再次转接到新鲜的萘（150mg/L）选择性液体培养基中继续培养，如此重复。经7个周期驯化培养，逐步将萘的浓度提升至400mg/L后，取适量富集培养液，梯度稀释后涂布在含萘（400mg/L）的选择性固体培养基平板上，置于30℃生化培养箱中；待菌落长出后，挑取菌落大小及形态显著的单个菌落在含萘选择性固体培养基上进一步纯化，直至得到形态单一的纯菌种。
1.2.3萘降解菌的鉴定
1.2.3.1革兰氏染色鉴定
取少量活化后的菌液，滴加在干净的载玻片上干燥固定后，滴加草酸铵结晶紫染色液染色2min，立即倾去染料，用细流蒸馏水冲洗直到流水为无色。再在涂菌区域滴加适量的革兰氏碘液，作用1min后倾去多余的碘液，最后用水流冲至流出液为无色。用吸水纸吸去载玻片上多余的水分，滴加体积分数为95%乙醇脱色30s左右至流出液为无色，接着用蒸馏水冲去乙醇后吸干，番红复染3min，水洗并使之干燥。在显微镜下用100倍油镜观察经染色的菌落颜色。
1.2.3.2 16S rDNA扩增及测序鉴定
将纯化的单菌落接种到LB液体培养基中扩大培养，取新鲜菌液用细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取基因组DNA。用通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)扩增其16S rDNA基因序列。PCR体系为：Super Mix 20μL、ddH2O 12μL、通用引物27F(10μmol/L)1μL、通用引物1492R(10μmol/L)1μL、模板DNA 6μL。扩增条件为：94℃、30s，55℃、30s，72℃、90s，35个循环。将PCR扩增得到的产物送至北京六合华大基因科技有限公司测序，测序结果在NCBI的Genbank数据库进行序列同源性比对，用MEGA 7.0进行同源性分析，依据邻接法（neighbor joining）构建系统发育树，确定萘降解菌AO-4的种属。
1.2.4萘降解途径中的部分关键酶基因的PCR扩增
选取萘降解途径中的关键酶萘双加氧酶的铁硫蛋白大亚基基因nahAC、水杨醛脱氢酶基因nahF、水杨酸羟化酶基因nahG及邻苯二酚2，3-双加氧酶基因nahH进行PCR扩增与鉴定。引物序列如下。
1.2.5萘降解菌对PAHs（萘、芴、菲、蒽、芘）的降解体系
将处于对数生长期的AO-4菌液（OD600=1）按一定体积接种至含特定浓度的萘、芴、菲、蒽、芘MSM培养基中，于温度30℃、转速130r/min条件下摇床避光培养，定时取样，按需测定菌体浓度OD600、培养液中PAHs含量及菌体脱氢酶活性，实验设置三组平行试样，并设置无菌组作为空白对照。
1.2.6环境单因素对萘降解的影响
本研究以降解率作为考察指标，研究环境因素包括温度、pH、萘初始浓度和菌种接种量对萘降解的影响，培养条件均在30℃、130r/min的摇床避光培养。
设置体系的不同温度分别为10℃、20℃、30℃、40℃，将处于对数生长期的菌液按2%（体积分数）的接种量接种至含有20mg/L萘的无机盐培养基（pH=7.0）中，定时取样测定不同温度下菌株AO-4对萘的降解率。
调整体系的初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，将处于对数生长期的菌液按2%（体积分数）的接种量接种至含有20mg/L萘的无机盐培养基中，定时取样测定不同初始pH下菌株AO-4对萘的降解率。
选取小于萘在水中溶解度的浓度（1mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L），将处于对数生长期的菌液按2%（体积分数）接种量接种至含有以上浓度的萘的无机盐培养基（pH=7.0）中，定时取样测定菌株AO-4对不同浓度的萘的降解率。
将处于对数生长期的菌液分别按0、1%、2%、5%的接种量（体积分数）接种至含有20mg/L萘的无机盐培养基（pH=7.0）中，定时取样测定不同接种量下菌株AO-4对萘的降解率。
1.2.7 PAHs浓度的测定及降解率计算
试样用等体积的乙酸乙酯萃取，在振荡器上通过1500r/min转速振荡5min后超声萃取10min，再经10000r/min转速离心5min后可分离有机相和水相，用0.22μm孔径的有机滤膜过滤乙酸乙酯萃取液后，利用高效液相色谱仪（HPLC）测定各PAHs的浓度，HPLC测试条件：ZORBAX Eclipse PAHs色谱柱，紫外检测器，柱温30℃，流动相为甲醇和水，流速1mL/min，进样量20μL，检测波长220nm。
降解率η的计算依据式(1)。
式中，C0为PAHs的初始浓度，mg/L；Ct为反应t时间后PAHs的浓度，mg/L。
1.2.8脱氢酶活性的测定
通过测定微生物的脱氢酶活性可以了解微生物对有机污染物的氧化分解能力，按照文献方法：在具塞试管中，加入降解后的培养液、Tris-HCl缓冲溶液（pH=8.5、0.05mol/L）、葡萄糖溶液（0.10mol/L）、TTC（质量分数为0.5%）各2mL，置于30℃恒温培养箱中避光反应。反应4h后，加入400μL浓硫酸中止反应，并加入5mL甲苯，1500r/min振荡10min进行萃取。待反应生成的红色三苯基甲臜（TF）被完全萃取到有机相时，将有机相在4000r/min下离心5min，过滤后测定滤液于486nm处的吸光度（OD486），以此表征萘降解菌的脱氢酶活性。
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