棉子糖抑制变异链球菌生物膜形成机制研究进展（二）
3.棉子糖对S.mutans GTF的影响
分析GTF相关基因的表达水平和葡聚糖产量，以评估棉子糖对S.mutans GTF的影响。如图4A所示，在1000μM棉子糖处理的S.mutans生物膜细胞中，所有与GTF相关的基因都显著下调。与对照相比，gtfB、gtfC和gtfD的表达分别下调了69%、74%和38%。与对照组相比，半乳糖还均匀地降低了GTF相关基因的表达40%到43%，而蔗糖则增加了GTF相关基因的表达水平，特别是gtfC和gtfD，分别增加了1.9到5.5倍(见图S5A和B)。此外，当棉子糖和蔗糖一起使用时，大多数GTF相关基因水平与对照组没有显著差异(见图S5C)。16S rRNA内参基因的表达不受任何处理的显著影响。
用固体硫酸铵从含有蔗糖的脑心输液(BHI)培养的S.mutans中提取GTFs，以评价其生产水不溶性葡聚糖的能力。然后将沉淀的GTF与棉子糖(0-1000μM)反应。以蔗糖为底物，用分光光度计测量葡聚糖色强度来估算葡聚糖的产量。当棉子糖浓度低于10μM时，S.mutans的葡聚糖产量没有显著变化(图4B)。然而，在100-1000μM棉子糖处理后，葡聚糖产量下降了18%-39%，并呈浓度依赖关系。这些结果表明，棉子糖影响了GTF相关基因的表达，并降低了S.mutans葡聚糖的产量(图5)。
S.mutans分泌的GTFs吸附在细胞膜和细菌表面。吸附的GTF与蔗糖衍生的葡聚糖结合。葡聚糖为S.mutans提供表面结合部位，介导对牙釉质的黏附和紧密的细菌聚集，最终促进生物膜的形成。然而，如果用棉子糖处理S.mutans生物膜，那么棉子糖有望阻止蔗糖衍生的葡聚糖与GTF结合。因此，S.mutans产生葡聚糖的活性降低，这可能会延缓生物膜的形成。
4.棉子糖在人工唾液包被HA爬片上的应用
使用人工唾液涂层的HA爬片来模拟人类口腔环境的条件。通过对S.mutans在HA平板上生物膜细胞的染色和计数来评价S.mutans的粘附性。如图6A所示，经1000μM棉子糖处理的HA爬片上的S.mutans生物膜细胞与对照相比染色不佳，这表明棉子糖处理后S.mutans细胞难以附着在HA爬片上。菌落计数法也观察到了类似的结果，在棉子糖处理后，HA爬片上的菌落数量减少(图6B)。
图6棉子糖(1000μM)处理后，S.mutans与涂有人工唾液的HA爬片的粘附性
(A)用CV染色评价细菌粘附性。在静态条件下，将S.mutans生物膜在HA爬片上形成24 h，并对其进行OD545检测。(B)用细胞计数法评价细菌粘附性。用标准平板培养法计算在HA爬片上形成的分离生物膜细胞的集落数。
此外，还通过扫描电子显微镜观察了棉子糖对S.mutans在HA爬片上生物膜形成的影响。涂布人工唾液和未涂布人工唾液的HA爬片在扫描电子显微镜下的图像没有差别(图7A和B)。图7C和图7D显示了S.mutans生物膜在HA爬片上形成的扫描电子显微镜图像。与对照组相比，1000μM棉子糖处理后生物膜的形成显著减少。半乳糖也对生物膜的形成有不利影响，而蔗糖则增加了生物膜的形成(见图S6)。这一发现表明，在与人类口腔环境相似的条件下，棉子糖可以有效地控制S.mutans生物被膜的形成。然而，这些结果并不能可靠地表明棉子糖在治疗龋齿方面的适用性。为了用棉子糖预防或治疗龋齿，还需要进行进一步的研究，包括临床演示和开发有效的棉子糖应用方法。
图7棉子糖处理(1000μM)后的S.mutans生物膜在人工唾液涂层HA爬片上的扫描电子显微镜图像。
(A)HA圆盘。(B)涂有人工唾液的透明质酸圆盘。(C)人工唾液涂层透明质酸圆盘上的S.mutans生物膜细胞。(D)人造唾液涂层HA爬片上经棉子糖处理的S.mutans生物膜细胞。
图S6经1000μM蔗糖和半乳糖处理后，在人工唾液包裹的HA圆盘上S.mutans生物被膜的扫描电子显微镜图像。
(A)涂有人工唾液的透明质酸圆盘。(B)人工唾液涂层透明质酸圆盘上的S.mutans生物膜。(C)人工唾液涂层透明质酸圆盘上经蔗糖处理的S.mutans生物膜。(D)经半乳糖处理的S.mutans在人工唾液涂层的透明质酸圆盘上的生物膜。
讨论
在这项研究中，我们发现棉子糖可减少人类致龋菌形成的生物膜，其中棉子糖抑制S.mutans生物膜形成效果比S.sobrinus更有效(图1)。S.mutans通过生产GTFs，以蔗糖为唯一底物合成粘性、水不溶/可溶性胞外葡聚糖，有助于增加细菌细胞表面的疏水性和生物膜的形成。RT-qPCR结果显示，棉子糖主要下调S.mutans中gtfB和gtfC的表达(图4A)。然而，经棉子糖处理后，gtfD表达略有下降。接着，不溶性葡聚糖的产量随棉子糖浓度的增加而下降(图4B)。
由于在龋齿患者的整个唾液中检测到大量的GTF，所以在本研究中，我们使用了唾液涂层的HA（牙釉质的主要成分）。S.mutans分泌的GtfC通常被结合到细胞膜中，表面吸附的GtfC会利用蔗糖生产葡聚糖。在我们的研究中，棉子糖处理降低了葡聚糖的产生，S.mutans进而难以粘附到唾液涂层的HA爬片，最终抑制HA爬片上生物膜的形成(图5)。
在棉子糖和蔗糖共培养的S.mutans中，蔗糖消耗和生物膜形成减少(图3A)，这表明棉子糖可能控制了S.mutans中GTF活性。这可能与棉子糖与GtfC结合的可能性有关(图3C)。棉子糖中的半乳糖与关键氨基酸残基Asp593以及亚基1位点的氨基酸残基有额外的相互作用，这可能会增强其与葡聚糖酶的结合亲和力。此外，在S.mutans中，半乳糖对生物膜形成和GTF基因表达的抑制活性与棉子糖类似，而蔗糖则相反(图S1B和图S5)。然而，这些结果并不能提供棉子糖与GtfC结合的直接证据，还需进一步的研究需要阐明棉子糖影响S.mutans GTF活性的具体机制。
Nagasawa等人报道了棉子糖在低浓度的蔗糖中诱导S.mutans生物膜的形成，这与我们的发现相反。尽管两项研究中生物膜形成的差异可能有很多原因，但我们谨慎认为这种差异与棉子糖浓度有关。这可以解释为，在高蔗糖水平下，棉子糖不足以抑制生物膜的形成，但这并不会降低棉子糖的活性。相反，0.03%以上的棉子糖处理会促进S.mutans生物膜的形成。这种差异被认为是由于用于抑制S.mutans生物膜形成的剩余棉子糖造成的。棉子糖可以作为链球菌中果糖基转移酶的底物，但GTF不能利用棉子糖。因此，在应用棉子糖调控S.mutans生物膜形成时，应考虑确定适合环境条件的棉子糖浓度。
棉子糖作为一种在天然产物中被发现的低聚糖，可以大大减少S.mutans在静态和流动条件下的生物膜形成。此外，经1000µM处理后，GTF相关基因表达量和葡聚糖产量降低。并且，经棉子糖处理后，细菌粘附减少，这减缓了在唾液涂层HA爬片上S.mutans生物膜的形成。因此，棉子糖作为一种天然物质在口腔环境中具有防治S.mutans生物膜的潜力。