4株金黄色葡萄球菌噬菌体形态、生物学特性、生长曲线及基因组特征（一）
金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，SA）是一种常见的食源性致病菌，广泛存在于水、空气、人和动物的皮肤等环境中。它可以引起伤口感染，诱发各种炎症，甚至污染食品和食用农产品，导致食物中毒事件的发生。使用抗生素（如氨苄西林、卡那霉素和万古霉素等）来预防和控制SA是最直接有效的方法，但是过度使用抗生素会使金葡菌产生耐药菌株，对人类和动物健康造成危害，甚至对生态环境安全构成威胁。因此，寻找可代替抗生素治疗的生物制剂非常重要。
噬菌体是细菌的病毒，能够专一性地裂解宿主细菌，作用机理明确。噬菌体对宿主细菌具有专一性能够直接攻击并杀害相应致病菌，并且具有易于筛选、数量庞大、成本低廉的优点。最重要的是用于人体和动物较为安全，不会导致菌群出现耐药性，甚至可以杀死耐药菌，适合用于食品中多重耐药SA的控制。目前，一些基于噬菌体的产品已经在市场上上市，如ListexTMP100和ListShieldTM，它们的安全性得到美国食品和药物管理局（FDA）的认可，并被美国农业部（USDA）批准可以作为抗菌加工助剂，用于食品抗菌。噬菌体根据是否能进行溶原途径的生活史分为烈性噬菌体和温和噬菌体，研究表明烈性噬菌体和温和噬菌体均具有控制SA生长的潜力。Ngassam-Tchamba等分离的三株烈性噬菌体（Romulus、Remus和ISP）在体外对与牛乳腺炎相关的SA具有良好裂解活性。分离的温和噬菌体JS02对SA表现出较强的清除能力，并且能抑制SA生物膜的形成。将温和噬菌体SA13随机缺失突变后的突变噬菌体SA13m应用于牛奶中抑制SA，结果显示金葡菌在冰箱温度（4℃）和室温（25℃）下均降低至不可检测的水平。Al-Anany等研究发现温和噬菌体HK97与亚抑菌浓度的抗生素环丙沙星联合使用，对SA具有良好清除效果。然而，尚未有研究系统性比较温和噬菌体和烈性噬菌体在形态、生物学特性以及基因组组成上的差异。
本研究分离出4株SA的噬菌体（包括2株烈性噬菌体和2株温和噬菌体），利用透射电镜观察其形态特征差异，随后对所分离噬菌体的效价、宿主谱、耐酸碱能力、热稳定性、一步生长曲线、最佳感染复数（Multiplicity of Infection，MOI）值等生物学特性进行比较研究，最后通过全基因组测序比较分析烈性噬菌体和温和噬菌体基因组特征。本文通过比较温和噬菌体和烈性噬菌体在形态、生物学特性以及基因组组成的差异，为筛选更加高效的噬菌体作为生物抑菌剂，用于控制食品加工过程中金葡菌污染奠定理论基础和数据支持。
1、材料与方法
1.1菌株及样品来源
47株SA菌株YZUsa1-YZUsa47分离自江苏省内养猪场；ATCC 29213购自北京百欧博伟生物技术有限公司；3株SA菌株MRSA 85/2082、MRSA JCSC4744和MRSA WZ153来自扬州大学生物危害因素防控重点实验室；霍氏肠杆菌（Enterobacterhormaechei）Eh-YZU05分离自猪粪便，单核增生性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）ATCC 1911、肠炎沙门氏菌（Salmonellaenteritidis）CICC 21513、大肠杆菌（Escherichiacoli）CICC 10664及最小弧菌（Vibrio mimicus）CICC 21613购自CICC菌种保藏中心。
1.2主要试剂和仪器
卢里亚-贝尔塔尼（Luria-Bertani，LB）培养基，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；Baird-Parker琼脂基础，购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；脑心浸出液肉汤（Brain Heart Infusion，BHI），购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；7.5%氯化钠肉汤，购自广东环凯微生物科技有限公司；丝裂霉素C购自上海麦克林生物公司。
SW-CJ-1F型无菌操作台，苏州净化设备制造有限公司；JEM-1200EX型透射电镜，日本电子株式会社；HC-2066型高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；H/T16MM型冷冻离心机，北京博劢仪器有限公司；BDY-2012型恒温摇床，上海百典仪器设备有限公司。
1.3噬菌体分离
1.3.1烈性噬菌体分离
利用SA菌株ATCC 29213作为宿主进行SA噬菌体分离。采集扬州市内污水样品500 mL，污水样品的前处理过程以及噬菌体分离纯化过程参照Chang等的方法进行。用8 000 r/min的高速离心机离心10 min以除去杂质，之后使用0.45μm和0.22μm滤器过滤除菌后，得到噬菌体原液。将3 mL 2×的LB培养基培养液和100µL培养至对数生长期的SA菌株ATCC29213加入处理后的污水中，在37℃的温度下摇床培养8 h以上。将培养后的培养物经过离心、过滤得到原液，并保存在4℃的冰箱。
1.3.2温和噬菌体分离
挑取纯化后的金葡菌YZUsa13和YZUsa14单菌落于LB液体培养基中，于37℃下摇床培养12 h，调整菌液浓度为2×107CFU/mL。分别在LB培养基中加入167μL浓度为0.3 mmol/L的丝裂霉素C和菌液，置于37℃下摇床培养6 h，每隔1 h取1 mL通过0.22μm滤膜后，与菌液各100μL加入10 mL离心管中，利用层平板法测定噬菌体滴度。
1.4透射电镜观察
噬菌体的形态学观察：先将噬菌体液进行浓缩，然后在200目碳涂层铜网上滴加20µL的浓缩后的噬菌体（1010PFU/mL）悬浮液，充分吸附约15 min后取出铜网使其自然干燥2～3 min。然后用2%（m/V）的磷钨酸钠（pH值为7.6）溶液染色2 min后，使用透射电镜（TEM，Hitachi H600A）观察噬菌体形态。
1.5噬菌体宿主谱的测定
噬菌体的宿主谱采用空斑法进行测定，通过双层平板法将100µL菌液（108CFU/mL）和5 mL的LB半固体培养基混匀后倒在LB固体培养基上，自然干燥后取10µL噬菌体培养液（MOI=100）滴在表面，倒放在37℃恒温箱中培养。每组实验平行重复3次。
1.6生物学特性测定
1.6.1最佳感染复数的测定
最佳MOI的测定方法：将菌液浓度调整至1×106CFU/mL，按照噬菌体和宿主菌的不同比例（0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10和100）将噬菌体和宿主菌混匀后37℃摇床培养8 h后，于8 000 r/min条件下离心10 min，过滤并测定效价，效价最高的比例即为最佳MOI。每组做三次平行实验。
1.6.2一步生长曲线（One-stepGrowth）的测定
一步生长曲线的测定方法：将噬菌体和108CFU/mL宿主菌按照最佳MOI混合，37℃静置培养7 min后8 000 r/min离心10 min，弃上清后加入5 mL的LB培养基重悬沉淀，放在37℃培养箱中培养。分别于不同时间点（0、5、10、15、30、45、60、75和90 min）或（0、10、20、30、40、50、60、75、90、105、120、135、150、165、180、200、220和240 min）取100µL梯度稀释后与宿主菌各100µL倒双层平板。每组实验平行重复3次。
1.6.3耐酸碱性实验
噬菌体的耐酸碱性实验：分别取1 mL噬菌体于若干10 mL的离心管中，分别加入1 mL pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0的SM缓冲液中，37℃下作用2 h后测定效价。
1.6.4热稳定性实验
噬菌体热稳定性实验：取1 mL效价约为108PFU/mL的噬菌体于试管中并放在40、50、60、70℃的恒温金属浴中依次作用20、40和60 min后测定效价。
1.7基因组测序及分析
对噬菌体SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的全基因组序列进行测定和分析。噬菌体基因组DNA提取参照文献中所述方法。分别采用琼脂糖凝胶电泳和Qubit®dsDNA HS分析试剂盒（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）对噬菌体基因组DNA进行定性定量。
通过Illumina HiSeq平台（Illumina，SanDiego，CA，USA）对噬菌体基因组序列进行测定，插入片段大小为500 bp。使用FGENESB（http://www.softberry.com）、GeneMarkS和Glimmer v3.02软件对开放阅读框（Open Reading Frames，ORFs）进行预测。通过InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/）和BLASTp对ORFs进行注释。将基因组信息上传至NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13和SAPYZU-SapM14的GenBank编号分别为OP432864、MW864252、ON229621和ON220160。
1.8噬菌体系统进化树构建
截至2021年4月，GenBank数据库中记录192个金黄色葡萄球菌噬菌体基因组序列。本研究通过软件kSNP3 v3.0对噬菌体SAPYZU-04、SAPYZU-15、SAPYZU-SapM13、SAPYZU-SapM14和上述192个SA噬菌体基因组序列的单核苷酸多态性（Single-Nucleotide Polymorphisms，SNPs）进行解析并构建系统进化树。以噬菌体ErwiniaphagephiEa2809作为外组噬菌体，并使用iTOL进行注释。
1.9数据分析
实验数据表示为平均值±标准差（Mean±SD，n=3），每组实验重复3次，取平均值。实验数据中点线图、柱状图由Origin 2023软件绘制完成。
4株金黄色葡萄球菌噬菌体形态、生物学特性、生长曲线及基因组特征（一）
4株金黄色葡萄球菌噬菌体形态、生物学特性、生长曲线及基因组特征（二）
4株金黄色葡萄球菌噬菌体形态、生物学特性、生长曲线及基因组特征（三）
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