重组口蹄疫病毒鉴定、生长特性测定及灭活疫苗制备（二）
2结果与分析
2.1重组质粒的构建及鉴定
凝胶电泳鉴定正确的重组质粒pOFS/NXVP1/TURG-H用PstⅠ进行酶切鉴定，凝胶电泳结果表明，产生了约591、3 282、7 200 bp的条带，与预期大小相符。测序结果表明重组质粒含有预期替换的G-H环基因。
2.2重组FMDV的拯救
重组质粒pOFS/NXVP1/TURG-H经NotⅠ酶线性化，转染BSR/T7细胞2 d后，部分细胞可见典型的FMDV致细胞病变效应，而未转染线性DNA的细胞未出现CPE。当约80%−90%的转染细胞出现CPE时收集细胞，反复冻融后继续在BHK-21细胞上连续传代。
2.3重组FMDV的鉴定
2.3.1 RT-PCR
收集的转染样品以VP1-F和VP1-R为引物，RT-PCR扩增VP1结构蛋白基因。琼脂糖凝胶电泳显示扩增出符合预期大小的白亮条带。对该PCR产物进行序列分析，结果表明重组病毒rHN/NXVP1/TURG-H含有替换的基因片段，说明成功构建了重组FMDV。
2.3.2免疫荧光试验
免疫荧光试验如图2所示，拯救的重组病毒感染的BHK-21细胞能与FMDV 3A单抗反应，可见特异绿色荧光，而对照细胞与FMDV 3A单抗作用未见荧光，表明拯救的重组病毒为FMDV。
图2重组FMDV的IFA鉴定
2.4重组FMDV的噬斑表型鉴定和生长曲线
重组FMDV和亲本病毒的噬斑表型如图3所示，rHN/NXVP1[(4.27±1.44)nm]和rHN/NXVP1/TURG-H[(4.11±1.39)nm]均可形成形态相似、平均直径相近的噬斑；一步生长曲线表明重组FMDV的复制动力学与亲本病毒相似，但重组FMDV的病毒滴度略低于(P>0.05)亲本病毒，说明FMD疫苗毒株G-H环基因的替换未明显影响病毒在BHK-21细胞上的复制。
图3 FMDV的噬斑形态和一步生长曲线
A：FMDV噬斑表型.B：FMDV一步生长曲线
2.5病毒中和试验
免疫猪28 d的血清用微量中和试验检测针对ME-SA、SEA和Cathay共3个拓扑型的4个谱系病毒株的中和抗体水平。如图4所示，该结果表明亲本病毒rHN/NXVP1和重组病毒rHN/NXVP1/TURG-H疫苗均产生了针对ME-SA、SEA拓扑型病毒保护性中和抗体(WOAH规定中和抗体≥1.65log10为保护)，其中亲本病毒rHN/NXVP1疫苗免疫的猪(5/6)产生了针对O/NXYCh/CHA/2018和O/XJ/CHA/2017病毒保护性中和抗体，3/6免疫猪产生了针对O/HB/HK/99病毒保护性的中和抗体，但未产生针对O/GXCX/CHA/2018保护性中和抗体；而重组病毒rHN/NXVP1/TURG-H疫苗免疫猪均产生了针对O/NXYCh/CHA/2018、O/XJ/CHA/2017和O/HB/HK/99病毒保护性的中和抗体，但只有1/6的猪产生了针对O/GXCX/CHA/2018病毒保护性的中和抗体。结果说明，疫苗株G-H环基因的替换显著提高了重组病毒对当前流行的O型SEA和ME-SA拓扑型FMDV的交叉反应性(P<0.05)。
图4 FMDV疫苗免疫猪血清中和流行毒株的平均抗体效价
3讨论与结论
近年来，反向遗传操作技术的发展为RNA病毒蛋白功能、致病机制机理以及新型疫苗创制等方面的研究提供了便利。通过反向遗传操作技术嵌合RNA病毒不同血清型、亚型毒株主要免疫蛋白或者优势抗原表位，能够提高疫苗株与流行毒株的交叉反应性，拓展病毒的抗原谱。如Kim等以禽流感病毒(avian influenza viruses,AIV)Apdm09株(H1N1亚型)为骨架，构建了嵌合H9N2亚型AIV的HA1区域和H5N8亚型AIV的HA2区域的重组AIV，该病毒制备的灭活疫苗免疫动物能诱导产生高水平抗H9和H5亚型AIV的中和抗体，并能够保护小鼠免遭这2个亚型AIV的攻击。Liao等在猪瘟病毒(classic swine fever virus,CSFV)(C株，基因1型)感染性克隆的基础上，构建了嵌合CSFV流行毒株(基因型2)E2蛋白N端抗原高变区1(90 bp)的重组病毒RecC-HAR1，该病毒的抗血清能很好地中和基因1型和2型的CSFV，表明嵌合CSFV高变抗原区，提高了不同基因型CSFV之间的交叉反应性。Rieder等发现嵌合O型或C型A12 FMDV G-H环的豚鼠抗血清能同时中和A型和O型或A型和C型FMDV，而嵌合C型G-H环A12 FMDV疫苗免疫猪也能产生交叉中和抗体，能完全保护猪免遭A型FMDV的攻击，部分保护猪免遭C型FMDV的攻击。鉴于此，本研究也利用已建立FMDV的感染性克隆，构建含3个拓扑型(Cathay+ME-SA+SEA)病毒株结构蛋白，主要免疫基因的嵌合FMDV，以期筛选抗原高效、广谱拓展的FMD疫苗候选毒株。
FMD疫苗株的筛选方法主要有2种：体内试验和体外试验。其中体内试验耗时、费力，而且需要价格昂贵的靶动物和高级别生物安全实验室，而体外实验操作简单，成本低廉。另外，FMD疫苗诱导机体产生中和抗体的水平与免疫动物的保护密切相关。一般情况下，动物中和抗体水平越高，保护率越高。因此，本研究首选体外微量病毒中和试验检测重组病毒和亲本病毒疫苗免疫猪血清对3个拓扑FMDV的交叉中和能力，初步评价其作为猪O型FMD疫苗候选株的潜力。本研究结果表明，与亲本病毒疫苗一样，重组病毒疫苗免疫猪均能产生抵抗SEA和ME-SA拓扑型病毒保护性平均交叉中和抗体水平(>1.65log10)，不能对Cathay谱系病毒产生保护性平均交叉中和抗体水平(<1.65log10)，但O/TUR/5/2009疫苗株G-H环基因的替换显著提高了重组病毒对当前流行的SEA和ME-SA拓扑型FMDV的交叉反应性(P<0.05)，推测这种免疫差异可能与G-H环上包含的免疫优势的抗原表位有关，但具体的机制有待进一步研究。
本研究构建的含3个拓扑型FMDV结构蛋白基因的重组病毒疫苗免疫猪显著提高了对O型SEA和ME-SA拓扑型FMDV的交叉反应性，对未来FMD疫苗的设计具有重要的指导意义。
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