基于MALDI-TOF微生物质谱菌种快速鉴定技术，助力微生物鉴定和污染溯源调查
近日，上海市食品药品检验研究院宋明辉博士发表在《Frontiers in Microbiology》期刊上的论文《A comprehensive technology strategy for microbial identification and contamination investigation in the sterile drug manufacturing facility—a case study》受到了行业内广泛关注和讨论[1]。该文章详细阐述了一种创新的综合技术策略-基于MALDI-TOF微生物质谱菌种快速鉴定技术和全基因组测序菌株分型技术，为制药企业在无菌药品生产车间中进行微生物鉴定和污染溯源调查提供了全新的视角和有效的技术手段。文章的发表对于提高制药企业的生产质量控制水平、保障药品安全具有重要意义，为行业内相关问题的解决提供了宝贵的参考和借鉴。
图1.菌株监测和溯源完整过程的示意图
前言：
微生物污染一直是药品制造面临的严峻挑战。药品，特别是注射剂和眼科药品等高风险无菌产品，一旦在生产和储存过程中发生污染，可能会造成不可逆转的损害，严重情况下，甚至会损害患者的健康和生命。统计表明，在2012年至2019年期间，美国FDA注册药品的所有召回中，有50%以上与微生物污染有关[2，3]。
了解药品生产过程中环境微生物的类型和分布是药企过程监测计划的重要部分，高效的微生物鉴定和表征策略对于有效的微生物污染控制至关重要。
目的：
本研究旨在基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，辅以测序技术，建立无菌药品生产过程中微生物鉴定和污染调查的综合策略，以监测污染菌并分析其分布特征和模式。
方法：
对无菌药品生产过程涉及的各个要素，包括原材料、人员、环境和生产用水系统，进行采样和菌株的分离培养，通过MALDI Biotyper质谱进行菌种鉴定，辅以测序技术进行菌株鉴定和分型，再对检测结果进行分析和评估。
结果：
从无菌药品生产车间历时3个月的环境监测项目中，共分离出292个菌株。细菌污染分布如表1所示，最大的污染源是生产环境（212株），占所有分离菌株的70%以上，其次是水系统（39株）。
表1.不同地点微生物的菌株、菌种和菌属数量分布。
根据菌株的分离部位、生长特征和菌落形态等信息，排除可能的重复菌株后，剩余241个菌株。鉴定结果表明，241个菌株分属于44个菌属的94个菌种。菌株数排名前5的主要污染菌约占菌株总数的70%，分别属于葡萄球菌（40.25%）、微球菌（11.20%）、芽孢杆菌（8.30%）、放线菌（5.81%）和类芽孢杆菌（4.56%）。19个优势菌种占所有94个菌种的64%，包括占明显优势的9种葡萄球菌，其中出现10次以上的有科氏葡萄球菌（33）、表皮葡萄球菌（27）和人葡萄球菌（10）。
科氏葡萄球菌出现了33次，分别出现于环境（A级3次、B级7次、C级20次）、人员（2次）和原材料（1次）中，证明其在整个过程中广泛存在。科氏葡萄球菌出现于环境监测的两个关键区域，大多数（28/33）科氏葡萄球菌分离于制剂生产区，只有5个来自原料药生产区。在从制剂生产区分离的28个科氏葡萄球菌株中，有两个来自A级洁净区。
图2.不同监测地点优势菌属的分布
为了确定其来源，作者开发了一种更具鉴别性的全基因组SNP分型方法来追踪传播途径。cgMLST将28个分离菌株分为11种基因型（SID=0.765），其中包含两个以上菌株的有A、B和C三个型。从制剂生产区的A级关键区域——层流柜中分离到的菌株H71和13个近缘分离株（20到172个SNP差异）被聚类为A型。菌株H71与C级区域几个采样点分离的菌株密切相关，即气闸（G2、G1、G32、G39、F28）、封盖室（H28、G30 F30）、走廊（F8、G19）等，这表明A级表面的污染很可能来自洁净度级别较低的C级区域，通过物质、空气或人员流动进行传播。在A级区域发现的菌株K6与从工作人员右手手腕上分离的菌株H66（38个SNP）密切相关，同属于B型，表明通过不良的人员操作或流动引入污染的可能性很高。
图3.28株污染菌科氏葡萄球菌的wgSNP分型结果。
结论
MALDI Biotyper微生物质谱鉴定系统一天内即可完成所有菌株的鉴定，在菌种水平和菌属水平的鉴定能力分别为75.8%和95.4%，不仅速度快、通量高，而且准确性和可靠性高，有望成为例行环境监测的一线工具。
从原料和环境表面分离出来的产孢菌分别为58%和32%，说明了原料质量控制和转移消毒的重要性。
基于SNP的系统发育分析表明，本案例中的环境污染主要与人员流动相关。菌株分型结果为后续的风险评估提供了准确可靠的信息，为采取有效的预防和纠正措施提供了很好的技术支撑。
本研究创新性地建立了主要基于MALDI Biotyper质谱菌种鉴定技术和全基因组测序菌株分型技术的无菌药品生产过程中微生物鉴定和污染调查的综合策略。该策略将促进制药行业开发改进生产和环境控制的流程，并指导如何为优化质控计划提供更合理可靠的证据。
编者注：
在本研究中，布鲁克MALDI Biotyper微生物质谱快速鉴定系统在该综合技术策略中发挥着快速高效的作用。即便该研究中微生物质谱鉴定采用的是2019年的数据库，但在微生物鉴定方面已经具有很高的准确率。而且，布鲁克每年都在持续更新数据库，随着MALDI Biotyper数据库的不断更新，其鉴定范围和准确率还会持续提高。
近期，已有研究把IR Biotyper全自动红外光谱微生物分型溯源系统应用于药品生产企业中的溯源、质控以及WGS分析的初筛工作。
可以相信，布鲁克MALDI Biotyper与IR Biotyper相结合的监测方案在制药微生物监测领域中，因其具备微生物快速鉴定、分型和溯源分析的能力，同时具有检测速度快、成本低以及可实现全面监测等优势，能够为制药企业提供更为有效的微生物监测解决方案，进而确保药品生产的安全性与质量。
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