莠去津对水稻根际土壤微生物菌群结构及降解基因丰度的影响（一）
莠去津(atrazine，ATZ)属于三嗪类芽前、芽后除草剂，在玉米、高粱、甘蔗等作物上广泛使用，主要防除多种一年生禾本科和阔叶杂草，具有防治效率高、成本低廉、杀草谱广等优点，在70多个国家及地区应用广泛。与此同时，由于莠去津迁移性较强且消解半衰期长，导致其在农田土壤、毗邻农田的地下水及地表水中频频被检出，在种植玉米后的土壤中莠去津的检出量可达0.9 mg/kg。环境中残留的莠去津易被植物吸收，对后茬敏感作物(水稻、小麦、甘薯等)造成药害，严重影响后茬作物的生长及安全生产。据报道，按照通常用量(38%莠去津悬浮剂1.5 L/hm2)施用，莠去津对小麦的生长影响较大，可造成小麦旗叶干枯、籽粒偏小等现象；采用低浓度莠去津(0.2～0.8 mg/L)处理水稻幼苗后，水稻生长受到抑制，细胞膜通透性增强，叶绿素含量下降，同时莠去津可在水稻籽粒中积累。另外，莠去津还能通过食物链(如谷物等)进入人体，对动物及人类的神经系统、生殖系统及内分泌系统具有潜在的威胁。因此，降低生态环境及农作物中莠去津的残留，对农业生产及人类健康具有重要意义。
土壤中微生物无处不在，其对土壤物质循环和农药残留修复起着重要作用，但残留农药反过来也会影响土壤微生物的多样性及功能基因的丰度。同时，根际微生物也会影响植物对农药的降解代谢。研究表明，根际微生物可以联合植物提高根际土壤中农药的降解效率，缓解残留农药对植物的毒害作用。Ahmad等发现，将根际降解菌群接种于双草醚(2和5 mg/L)污染土壤，可以增强小麦对双草醚的降解作用，降解率可高达100%；Salam等发现，在种植前将甘蔗茎秆浸泡在含假丝酵母菌酵母CandidaVITJzN04(3×105CFU/mL)的YEPD培养基中，处理5 d后种植在林丹(100 mg/kg)污染土壤中，可以显著增强甘蔗根际林丹的降解，使其降解半衰期从43.3 d减至7.1 d。近年来，关于莠去津降解菌的筛选及应用有较多报道，同时降解菌的降解基因也已明确，包括atzA～atzF，其中模式菌株Pseudomonassp.ADP包含了所有降解基因，能将莠去津完全矿化。然而，目前关于莠去津降解菌的研究主要集中于离体条件下菌株对莠去津的降解功能探究，以及菌株在修复莠去津污染土壤中的应用，但关于莠去津降解菌在“土壤-植物”系统的修复应用报道较少，菌株对植物耐受莠去津胁迫的影响机制也尚不清楚。
本研究采用盆栽试验模拟水稻的大田生长环境，研究了莠去津对水稻根际微生物菌群结构及降解基因丰度的影响，并从水稻根际土壤中分离纯化出一株莠去津降解菌Pseudomonassp.AT2，将其应用于莠去津污染土壤，探究了AT2对“土壤-水稻”系统中莠去津降解的影响及机制，以期为保障水稻的安全生产提供一定的理论基础。
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1药剂及试剂98%莠去津(atrazine)原药购于先正达南通作物保护有限公司，称取0.02 g(精确到0.0001 g)莠去津原药，用50 mL乙腈完全溶解，配制成400 mg/L的莠去津母液，于4℃保存，待用；乙腈为色谱纯。无机盐(MSM)培养基：MgSO4·7H2O 0.40 g，FeSO4·7H2O 0.20 g，K2HPO40.20 g，(NH4)2SO40.20 g，CaSO40.08 g，去离子水1 L，pH 7.0～7.2，并于121℃灭菌20 min，备用。植物总RNA提取试剂盒购于北京庄盟国际生物基因科技有限公司；反转录试剂盒、Green qPCR SuperMix购于北京全式金生物技术股份有限公司；引物由通用生物(安徽)股份有限公司合成。
1.1.2供试土壤采自江苏省南京市农田(0～20 cm)，土壤类型为黄棕壤(N 35.03°；E 118.87°)，其基本理化性质为：pH 7.24，黏粒含量27%，有机质含量为24.61 g/kg，有机碳含量为7.44 g/kg。土样去除植物根系后过2 mm不锈钢筛网，备用。
1.2根际土壤微生物群落多样性分析
莠去津污染土壤的制备参照程金金等的方法。取1 mL 400 mg/L的莠去津母液，采用100 mL丙酮稀释后，均匀添加至500 g供试土壤中并混合均匀，通风放置24 h至丙酮挥发完全，获得土壤中莠去津终浓度为0.8 mg/kg的污染土壤，该浓度在已报道的土壤中莠去津的残留浓度范围内。均匀喷洒去离子水至田间最大持水量的60%，以不添加莠去津的土壤作为空白对照。将消毒后的水稻种子置于育苗盘中，当生长至三叶一心期时，选取5株长势一致的水稻苗移栽至装有500 g土壤的烧杯中，每个处理重复4次。每个烧杯中添加30 mL无菌水，每天补充水至初始水平，置于水稻温室中培养。培养条件：200μmol/(m2·s)，14 h光照/10 h黑暗；昼/夜温度为30/25℃。培养6 d后，参照冯发运等的方法收集每个烧杯中水稻的根际土壤，得到4个平行的待测土壤样品。利用FastDNA®Spin Kit(MP Biomedical，Solon，OH，美国)提取土壤DNA，并通过NanoDrop 2000超微量核酸测定仪和琼脂糖凝胶电泳法评估所提取DNA的样品质量。以合格的土壤DNA样品为模板，利用特异性引物338F(ACTCCTACGGGA GGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGT WTCTAAT)对16S rRNA基因的V3-V4区进行扩增。采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)进行切胶回收，回收的产物送至上海美吉生物医药科技有限公司，基于Illumina Miseq平台进行高通量测序，并通过云平台进行数据分析。
1.3根际土壤中莠去津降解基因丰度测定
根据已报道的莠去津降解基因引物，采用定量PCR仪Bio-Rad CFX96对土壤中莠去津降解基因进行扩增，测定其丰度。将降解基因的PCR产物连接至pEASY-T3载体，并验证基因序列。选择序列正确的质粒以10倍梯度稀释，测定不同浓度质粒的CT值，并换算成拷贝数，建立莠去津降解基因质粒的标准曲线。将1.2节中提取得到的不同土壤DNA进行荧光定量PCR扩增，并结合标准曲线计算各处理样品中莠去津降解基因的拷贝数。采用Green qPCR SuperMix进行荧光定量PCR扩增，反应体系为：10μL 2×Mix，0.4μL上游引物，0.4μL下游引物，1μL DNA模板，8.2μL无菌水。反应程序为：94℃30 s，1个循环；94℃5 s，55℃15 s，72℃10 s，40个循环。
1.4莠去津降解菌的筛选及鉴定
取1.2节中制备的土壤样品5 g，置于LB液体培养基中富集培养24 h后，依次转移至含莠去津(2、10和50 mg/L)的MSM液体培养基中梯度驯化3次。取驯化培养后的菌液涂布于莠去津终浓度为10 mg/L的MSM固体培养基上，培养24 h后，挑取不同形态的菌落进行多代划线培养，得到纯化菌株。将纯化后的单一菌株接种于含10 mg/L莠去津并以其为唯一碳源的MSM液体培养基中进行复筛，同时以不接菌的处理组为对照，30℃、180 r/min振荡培养4 d后，通过高效液相色谱仪测定莠去津含量并计算降解率。MSM液体培养基中莠去津的提取与检测参考李阳阳等的方法。提取其中具有降解功能菌株的DNA，用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增，并将扩增后的产物送至南京擎科生物科技有限公司测序，利用NCBI比对测序结果并构建系统进化树，结合菌株的形态及生理生化特征，确定降解菌的菌属。
1.5降解菌对莠去津胁迫下水稻的影响
试验共设置4组处理：1)对照土壤+对照水稻；2)对照土壤+接菌水稻；3)含莠去津土壤+对照水稻；4)含莠去津土壤+接菌水稻，其中莠去津含量均为0.8 mg/kg。选择降解能力最强的菌株AT2为目标菌株，用灭菌后的生理盐水配制菌悬液至OD600约为1.0。将2份长势一致的三叶一心期水稻苗置于上述菌悬液中浸根处理12 h，得到2份接菌水稻；2份对照水稻采用等量的无菌生理盐水进行相同处理。将处理后的4份水稻分别种植于对照土壤和莠去津污染土壤中，培养6 d后测定水稻的相关生理指标、土壤和水稻中莠去津的含量以及水稻中莠去津降解基因的表达量。土壤和水稻中莠去津的提取与检测方法采用Ma等的方法，回收率为89.6%～102.3%，满足残留农药检测要求。
水稻中莠去津降解基因表达量的测定：通过液氮将植物样品研磨至粉末，利用植物总RNA提取试剂盒提取RNA，并通过1%琼脂糖凝胶电泳和超微量紫外分光光度计检测RNA的完整性和纯度，取上述合格的RNA样品(1.0μg)，经gDNA Eraser消除DNA后合成cDNA，并作为模板进行荧光定量PCR扩增。根据已报道的水稻中莠去津降解基因设计特异性引物，并以OsActin为内参基因。荧光定量PCR体系与反应程序同1.3节。
1.6数据分析
通过Excel 2016和Origin 2021软件制图。试验结果采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(ANOVA)，并用Tukey检验进行多重比较；或采用Student’st-test(t检验)进行分析。
莠去津对水稻根际土壤微生物菌群结构及降解基因丰度的影响（一）
莠去津对水稻根际土壤微生物菌群结构及降解基因丰度的影响（二）
相关新闻推荐
1、温室大棚内不同微生物菌剂对秸秆降解率影响（培养基、实验方法）