2.4细菌ROS活性检测

过量ROS会造成细菌氧化损伤，甚至使细菌活性受到影响。重金属氧化损伤所产生的ROS可攻击膜脂，导致膜功能障碍，同时对蛋白质、DNA和细胞内系统造成损害。图4为暴露于Zn2+和Cd2+后细菌体内的ROS产生量变化。单一金属对细菌毒性影响的结果表明：Zn2+浓度从2μg∙mL-1增加到20μg∙mL-1，E.coli和B.subtilisti产生的ROS变化显著（P<0.05）。Zn在酶催化反应、细胞代谢、信号传递等生理调节过程中发挥重要作用，有助于抑制自由基和ROS的产生，从而可增强蛋白质的稳定性和抗氧化酶的活性。然而过量的Zn会起到毒性作用，Zn会与其他金属发生错金属化阻断蛋白质硫醇表达，从而引发基本生物功能的破坏，导致细胞毒性。Cd2+浓度从2μg∙mL-1增加到10μg∙mL-1，E.coli和B.subtilisti产生的ROS变化显著（P<0.05），虽然Cd2+浓度低，但其毒性很高。Cd2+浓度的增加会诱导细菌产生过量的ROS，造成DNA损伤，最后使生物体发生细胞凋亡。此外，细胞内ROS产生量的增加可能与金属引起的抗氧化剂消耗（如谷胱甘肽）有关。直接影响重金属对生物体毒性效应的不是吸附金属离子的数量，而是能够与酶、蛋白质、DNA以及其他细胞结构的功能基团反应的离子或分子的数量。

图4 Zn2+和Cd2+对两种细菌ROS产生量的影响

细菌处于Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白联合暴露的条件下时，随着浓度增加两种菌体ROS的产生量整体呈现先上升后降低趋势（图5），各处理组细菌ROS产生量都低于对照组（除了浓度为2μg∙mL-1的Zn2+-Cry1Ac复合体对E.coli的ROS产生量为103.1%）。如图5所示，联合暴露下E.coli和B.subtilis的ROS产生量呈显著性变化（P<0.05），这与单独金属离子暴露下细菌ROS产生量呈现的趋势不同，是与金属离子与色氨酸的吲哚基团之间的N配位有关。在Zn2+-Cry1Ac和Cd2+-Cry1Ac体系中，Zn2+和Cd2+对吲哚基团（色氨酸）中的N具有很强的结合能力，导致其对细菌的氧化损伤降低，从而进一步降低金属毒性。Zn2+-Cry1Ac处理比Cd2+-Cry1Ac处理下E.coli体内ROS产生量多：一方面，Cd2+会诱导细菌防御机制响应诱导谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）和金属硫蛋白（MT）等几种保护酶的升高，这些酶能够拮抗Cd的毒性，更多的抗氧化酶能够清除生物体中Cd胁迫产生的超氧阴离子和过氧化氢等。另一方面，用纯Cd2+溶液（如CdCl2）进行培养时，其对细菌的毒性大于Zn2+溶液。Cd2+-Cry1Ac较Zn2+-Cry1A对细菌的毒性低，这是因为Cd2+与其他物质（例如各种离子或有机成分）之间的相互作用通常会改变Cd2+的毒性，此时Zn2+-Cry1A联合暴露对细菌毒性更强。

图5 Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白联合暴露对两种细菌ROS产生量的影响

2.5发光细菌急性毒性检验

发光细菌的发光抑制率反映重金属对细菌的毒性效应。有研究发现Zn浓度大于1.2 mg∙L-1时对发光细菌的发光强度有明显抑制作用，Cd和Pb浓度改变对发光强度的影响不显著。如图6所示，不同浓度Zn2+、Cd2+均对Vibrio fischeri产生抑制，且抑制率随金属浓度增加而变大（P<0.05）。Zn2+浓度从2μg∙mL-1增加到20μg∙mL-1，Zn2+对Vibrio fischeri的发光抑制率由41%增加到85%；Cd2+浓度从2μg∙mL-1增加到10μg∙mL-1，Cd2+对Vibrio fischeri的发光抑制率由39%增加到61%；即不同浓度金属离子的毒性效果不同，浓度愈高，毒性愈强。相同浓度下Zn2+对Vibrio fischeri的抑制率大于Cd2+，即Zn2+对Vibrio fischeri的毒性较大。青海弧菌Q67和费氏弧菌的毒性实验结果也表明Zn2+的毒性大于Cd2+，可能是Zn2+与硫的亲和力强于Cd2+，导致其对发光细菌毒性较大。

图6不同浓度Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白及复合体系对费氏弧菌生长抑制率的影响曲线

从图6（c）中可以看出，各处理对细菌作用15 min后，随着Cry1Ac蛋白浓度升高，Vibrio fischeri的发光抑制率由负到正，这是由于Cry1Ac蛋白本身含有具有内源荧光特性的色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr），其中最主要的是色氨酸。具有荧光特性的Cry1Ac蛋白与Vibrio fischeri结合导致荧光强度增强，因此抑制率为负，随着Cry1Ac蛋白浓度的增加，抑制率逐渐增大，但不会对细菌造成毒性影响。研究发现，转基因Bt稻草（Cry1Ab蛋白）在淹水条件下分解的Cry1Ab蛋白对细菌不会造成毒害作用，即Bt蛋白不会对土壤微生物构成危害。

Zn2+、Cd2+与Cry1Ac联合暴露下Vibrio fischeri的生长抑制率也由负到正，这是由于发出荧光的Cry1Ac蛋白和Zn2+、Cd2+结合使自身荧光强度有所减弱。研究表明，具有荧光特性的Cry1Ac蛋白与不发光的金属离子相互作用，降低了Vibrio fischeri产生的荧光强度，这与本实验的结果一致。仇爱锋等的研究表明随着Cd2+和Cu2+对费氏弧菌暴露时间的延长，菌体细胞膜通透性增强，毒性增大。本研究中，随着浓度的升高各处理对Vibrio fischeri的抑制效果增强，相同浓度下各处理对Vibrio fischeri的抑制效果表现为Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。

3、结论

（1）高浓度的Zn2+、Cd2+会对E.coli、B.subtilis生长产生抑制作用，细菌存活率也显著降低（P<0.05），两种细菌相比B.subtilis的耐受性强于E.coli。

（2）Cry1Ac蛋白不会对细菌造成毒性损伤；二元体系联合暴露时Zn2+、Cd2+均与Cry1Ac蛋白（吲哚基团）结合，使得Zn2+、Cd2+对两种细菌的毒性降低。

（3）两种细菌活性氧产生量表明Zn2+和Cd2+对E.coli和B.subtilis造成了严重损伤，Zn2+-Cry1Ac和Cd2+-Cry1Ac联合暴露对E.coli和B.subtilis没有造成严重损伤。

（4）Zn2+、Cd2+及Cry1Ac蛋白浓度增加对Vibrio fischeri的发光强度抑制增强，相同浓度下各处理体系的发光抑制效果为Zn2+>Cd2+>Zn2+-Cry1Ac>Cd2+-Cry1Ac>Cry1Ac。

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