全自动菌落计数仪操作方法及实验步骤【应用实例】
菌落是细菌或霉菌在一定温度、时间、湿度条件下，于营养物质中生长繁殖而形成的能够被我们所识别的生长物，形成以母细胞为中心的一团肉眼可见的，有一定形态、构造等特征的子细胞集落。菌落总数是指在一定条件下（培养时间、适宜温度、pH值等）每克/毫升被测样品所生长出来的菌落的总体数量。在纺织品微生物的检测过程中常常会存在菌落计数问题，若平皿上的菌落数较少时可肉眼直接观察计数，但在高污染样品的检测或者抗菌性试验过程中，平皿上的菌落数较多，几十个甚至几百个，这种情况下要完成大批量检验检疫时肉眼观察菌落数存在耗时严重、眼睛易疲劳。另外，仅留下一个统计数字，原始数据结果无法保存，缺乏后期的数据分析，不利于实现检测的准确性及数据化管理。
本试验选择自主合作研发的全自动菌落计数仪，对平皿上的菌落进行计数，与人工肉眼计数结果进行比较，以验证全自动菌落计数仪的准确性、精密度和重现性，从而确定该全自动菌落计数仪是否符合菌落计数要求，能否应用于纺织产品中微生物的检测计数。
1、材料与方法
1.1试剂与材料
营养琼脂培养基、沙氏琼脂培养基、营养肉汤，购于北京陆桥技术股份有限公司。
普通一次性使用口罩（非灭菌型）、医用口罩（灭菌型）的试验样品均来源于市售。
1.2仪器与设备
全自动菌落计数仪（丹麦BioSense公司）、生物安全柜（ESCO AC2-6SI）、生化培养箱（赛默飞RI-250）、霉菌培养箱（赛默飞RI-150）、立式压力蒸汽灭菌器（雅马拓SQ510C）。
1.3标准菌株
细菌：大肠杆菌ATCC 8099、金黄色葡萄球菌ATCC 6538、枯草芽孢杆菌ATCC 6633，购于广东省微生物研究所。试验前按照说明书对所涉及的标准菌株进行活化。
1.4试验方法
1.4.1菌悬液的制备
采用二步预培养程序制备每种细菌的接种菌悬液。从第3代菌种的试管斜面中取一环在营养琼脂培养基平皿上画线，在（37±1）℃下培养（22±2）h，然后在三角瓶中添加20mL营养肉汤，用接种环从已培养的平皿中挑一个典型的菌落，接种到营养肉汤中，在（37±1）℃下130r/min振荡培养（19±1）h，即制得接种菌悬液，采用麦氏比浊法调整活菌数的浓度，活菌数应达到1×102CFU/mL～5×102CFU/mL，经稀释法测定活菌数的浓度。
1.4.2准确性试验
试验选用一次性平皿的倾注法进行验证，以检测细菌菌落总数和真菌菌落总数。随机选取不同批次的普通一次性使用口罩（非灭菌型）至少3个包装，从每个包装中取样剪碎、称取（10±1）g样品，加入200mL灭菌生理盐水，充分混匀后得到一个生理盐水样液。自然沉降后取上清液做菌落计数，共接种10个平皿，每个平皿中加入1mL样液，其中5个平皿倒入45℃左右的熔化的营养琼脂培养基15 mL～20mL，混匀凝固后，置（35±2）℃培养48h；另外5个平皿倒入45℃左右的熔化的沙氏琼脂培养基15 mL～20mL，混匀凝固后，置（25±2）℃培养5～7天，检测结果分别用目测法和仪器法进行计数，分析两种计数结果的方法是否存在显著性差异。
1.4.3精密度试验
随机选取10个不同批次的医用口罩（灭菌型），每个样品称取（0.4±0.05）g，折叠成边长为18mm的正方形，接种0.2mL上述浓度的菌悬液（大肠杆菌:金黄色葡萄球菌:枯草芽孢杆菌=1:1:1）后，立即向瓶内加入20mL冰冷生理盐水，振荡器振荡（5s、5次），洗脱试样上的活菌，用10倍稀释法稀释洗脱液，测定试样上的活菌数，不接种菌悬液的样品做空白对照，每个样品做7组平行试验，采用仪器法进行计数，并计算相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.4.4重现性试验
同一个平皿采用两种计数结果的方法，不同人员分别进行计数，以相对标准偏差来评价两种计数方法的重现性，并计算相对标准偏差。
1.4.5数据分析
结果准确性采用minitab软件进行配对T检测分析，仪器法的精密度试验结果偏差应小于10%，重现性的相对标准偏差应小于10%。
3、结果与分析
3.1准确性试验
采用一次性平皿倾注法对随机选取的20个批次普通一次性使用口罩（非灭菌型）进行菌落总数测定，分别采用目测法和仪器法对测试结果进行计数，见表1。
表1两种计数方法的准确性验证
目测法与仪器法所得的细菌菌落总数结果RSD小于10%的符合率为90%，所得的真菌菌落总数结果RSD小于10%的符合率为85%，可知平板菌落数采用目测法和仪器法检测的偏差不大。另外，当菌落数落在30CFU/皿以下时，仪器法的准确性欠佳，RSD大于10%，这可能是菌落与培养基的颜色较为接近，或者培养皿上有气泡且颜色与菌落差异不大时造成的误判，或者皿内存在的水雾甚至小水珠也会影响计数仪的识别效果。对两种计数结果进行配对T检测分析，可知在95%置信区间内，P值大于0.05，在统计学上无显著性差异。
3.2精密度验证
随机选取10个不同批次的医用口罩（灭菌型），添加适宜浓度的菌悬液，采用仪器法对测试结果进行计数，见表2。
表2菌落计数的精密度验证
由表2可知，两种计数方法的相对标准偏差均小于10%，其中仪器法的平均相对标准偏差为1.26%，目测法的平均相对标准偏差为1.81%，仪器法的精密度整体上高于目测法。另外，对于部分样品，存在仪器法的计数结果稍大于目测法，这主要是由于部分平皿上特别小的菌落，肉眼因看不清而未计数，而全自动菌落计数仪可放大后再计数。
3.3重现性验证
不同试验人员分别采用两种计数方法对同一个平皿进行计数，以相对标准偏差来评价两种计数方法的重现性，见表3。由表3可知，不同人员采用两种方法对菌落进行计数，其相对标准偏差均小于10%，符合重现性要求。
表3两种计数方法的重现性验证
通过不同试验人员对全自动菌落计数仪（图1）进行操作，可知仪器操作相对简便，图像采集过程中无需调节光度，系统能自动调整使其照出最佳效果；根据实际需求可选择4个皿或6个皿一键计数，选择适宜的待测组别即可进行读数；计数过程中可人为增加或删除菌落个数进行人工修正，有样本稀释度输入、报告输出等功能。
图1全自动菌落计数仪的外观图
4、结论与讨论
本研究主要探究了不同计数范围的菌落计数，通过对目测法和仪器法的计数结果进行分析，在95%置信区间P值均大于0.05，在统计学上无显著性差异，其精密度试验和重现性试验结果均在10%以内。全自动菌落计数仪在操作过程中，对大部分菌落能自动计数，极少部分需要人为识别进行增加、删除或切割，或者当样品对培养基背景具有干扰时，也需要人为识别，进而完善计数效果；整体上来说，对于正常的无背景干扰的菌落计数，仪器计数的准确度和精密度均较优，计数速度快，且仪器操作简便、功能齐全实用，能直接保存计数结果和平皿图片，利于后期查看。在日常纺织产品检测中，全自动菌落计数仪的使用可有效减少试验人员的工作负担，确保试验数据的可追溯性。今后，还需要不断完善仪器功能，为试验研究提供更高端、更高质量的服务。
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