快速药敏检测方法、发展现状|拉曼光谱在RAST领域中的应用（一）
细菌感染每年导致全球800多万人死亡,占所有报告的与感染有关的死亡人数的50%以上。在得到准确的药敏结果前,30%～50%的细菌感染患者接受的一线抗菌药物治疗无效,而且每延迟1 h给予正确的抗菌药物治疗,患者的存活率就会下降10%。为了缩短药敏检测时间,各种快速药敏检测(RAST)方法被开发出来,如基于光学、电阻抗、微流控、质谱及拉曼光谱等原理的技术,这些技术主要是基于细菌生长或代谢表型的药敏检测。但由于不同细菌繁殖速度存在差异,基于细菌生长的技术可能受限,在抗菌药物作用下,细菌代谢表型的变化会更快。以细菌代谢表型检测为目的的基于拉曼光谱的药敏检测技术已被证明是有前途的RAST替代方案。本文分析细菌耐药性的流行病学现状和RAST发展现状,进一步讨论基于细菌代谢表型检测的拉曼光谱在RAST方面的研究进展,为RAST的研究提供新思路。
1 快速药敏检测方法原理
1.1基于光学原理的RAST方法
ZHANG等通过大体积溶液散射成像(LVSI)系统直接对临床尿液标本成像,并使用单细胞分裂跟踪方法分析尿液病原菌图像,在60 min内就得到了药敏结果,与金标准药敏结果完全一致。CANSIZOGLU等开发了一种快速超灵敏探测器(RUSD)药敏检测平台,可以检测到极低细胞密度的细菌,在2～4 h内可测得常用抗菌药物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌的最低抑制浓度(MIC)。
1.2基于电阻抗原理的RAST方法
HANNAH等用琼脂糖基水凝胶沉积物修饰丝网印刷电极,将敏感和耐药的金黄色葡萄球菌菌株置于含有抗菌药物的电极上,利用电化学阻抗谱(EIS)和差分脉冲伏安法(DPV)监测细菌生长并建立生长曲线,在45 min内即可区分敏感菌和耐药菌。PITRUZZELLO等基于电阻抗可直接检测活细菌代谢的原理,研究抗菌药物处理下单个细菌的电反应,可在30～60 min内测得药敏结果。
1.3基于微流控技术的RAST方法
LI等开发了一种在单细胞水平进行快速病原体分类和药敏试验的适应性微流控系统,通过结合可调微流体阀和实时光学检测,细菌被捕获并根据其物理特征进行分类,在单细胞水平监测它们在抗菌药物作用下的生长,最短30 min就可以确定细菌的耐药性。KANDAVALLI等也提出了一种在微流控芯片中基于单细胞水平的药敏检测方法,该研究使用4种抗菌药物和7种细菌的混合标本进行检测,可在2 h内确定混合标本中各种细菌的药敏谱。
1.4其他RAST方法
ZHANG等通过核苷酸胶体染料(SYBR GreenⅠ)和碘化丙啶(PI)染色,在30～60 min内检测到100株肺炎克雷伯菌临床分离菌株对4种不同抗菌药物的耐药性。KLLAI等提出了一种基于流式细胞术的RAST方法,在培养4 h后就能观察到细菌的生长,药敏结果的准确率在87%以上。LI等采用基质辅助激光解吸/电离时间飞行质谱法(MALDI-TOF MS)检测了大肠埃希菌在有无黏菌素条件下的生长状况,大肠埃希菌与抗菌药物孵育2 h后,根据敏感株和耐药株之间的相对生长值测定了黏菌素的MIC。YANG等以肺炎克雷伯菌和环丙沙星为细菌-抗生素模型,采用RNA测序技术确定了细菌暴露于抗菌药物后的RNA标志物用于药敏检测,肺炎克雷伯菌暴露于环丙沙星10 min就可检测到RNA标志物的变化,然后通过实时定量PCR在11株肺炎克雷伯菌分离株中进行验证,准确度良好。
2拉曼光谱的基本原理及优势
拉曼光谱基于非弹性散射原理,是一种非侵入性光谱技术,可用于分子表征和成像,具有高空间分辨率。在生物学中,它特别适用于生物分子的鉴定和细胞的光谱特征分析。传统的拉曼光谱信号强度低、抗干扰能力弱,检测时需要较长的积分时间,限制了其在RAST中的应用。
表面增强拉曼光谱(SERS)相比于自发拉曼光谱,有高灵敏度的优点,其基于离域电子集体相干振荡导致的激光与电磁场耦合,在金属纳米结构之间的间隙连接处或纳米间隙处通过局部表面等离子体共振产生“热点”,从而产生强大的局部电磁场聚焦增强,可以将吸附在金或银纳米粒子上分子的拉曼信号增强1010～1014倍。
共聚焦拉曼光谱(CRS)能有效消除焦平面外的信号干扰,其空间分辨率、信噪比、精度等性能均高于普通拉曼光谱,它与显微技术联用,结合可移动的扫描平台,可在三维空间中精确定位样品和成像。受激拉曼光谱(SRS)是一种无损的、无标记的振动光谱学方法,通过相干激发分子键振动并保留光谱指纹,克服了传统的自发拉曼散射固有缺点,可实现高速、高化学特异检测。此外,SRS成像比传统自发拉曼成像速度快1 000倍以上,且不受样品自发荧光干扰。