肺炎克雷伯菌生长曲线及小鼠肺炎模型构建
肺炎克雷伯菌是存在于正常人肠道及呼吸道的重要的条件致病菌，它可黏附于机体腔道黏膜表面，分泌多糖基质，形成生物被膜。
细菌形成生物被膜后，常使感染变得难治、易复发。由于胞外黏多糖的屏障作用、通过影响宿主免疫功能及细菌的基因表达等作用，而使其对抗生素产生耐药。本文将通过肺炎克雷伯菌滴鼻感染小鼠，构建肺炎模型进行案例分析，给与头孢氨苄治疗评估药效。
表1.动物实验分组及给药
用接种环刮取平板上的全部菌落，分别接种到含有5mL新鲜LB液体培养基中，37℃、150r/min振荡培养至OD600约为0.6-0.8。将菌液依次稀释为10的负一次方，10的负二次方至10的负九次方，测定OD600，并分别涂板统计菌落数，计算OD值与CFU做生长曲线。
菌体培养离心后用无菌的PBS洗涤重悬3次，根据OD值和生长曲线将菌液调整至合适的稀释度、经呼吸麻醉后滴鼻感染。
小鼠经滴鼻感染后给药组给与头孢氨苄治疗（15mg/kg，灌胃），每天一次。
D0采集空白血清，攻毒后观察动物体重及存活率，根据体重及存活情况暂定感染后于D3，D5每剂量组随机处死1只，采集血液和肺脏灌洗液测细菌载量，肺脏取样做HE。
检测指标：
眼眶取血，静置1h，室温离心2500 rcf 15min分离血清，-80摄氏度存储。
取小鼠全部肺脏，一部分进行细菌载量测定，另一部分4%PFA固定后进行HE染色。
将菌液依次稀释为10的负一次方，10的负二次方至10的负九次方，测定OD600，并分别涂板统计菌落数,计算OD值与CFU计算生长曲线。
图1.肺炎克雷伯菌生长曲线
实验动物的体重作为间接测定感染及治疗效果参考指标。研究期间体重测量频率为1次/天，动物体重的变化趋势如图2所示。小鼠经滴鼻感染后体重持续下降，随着感染细菌量增加体重下降越明显，经头孢氨苄治疗体重下降趋势减缓。
图2.不同组别小鼠体重变化趋势
肺炎克雷伯菌LD50为6.9*106 CFU/只，滴鼻攻毒后D2-D3小鼠症状最明显，体重下降严重，陆续出现死亡，小鼠经过头孢氨苄治疗后状况优于未治疗组；由于菌株毒力较强，攻毒低剂量组存活率高于高剂量组。
图3.不同组别小鼠生存曲线
小鼠肺脏组织细菌载量随着接种量的增加而增加，G4组肺组织细菌载量为3.12*108，G2组细菌载量为6.1*108。给与头孢氨苄治疗后细菌载量明显下降，G1组细菌载量为2*108（图4）。
图4.不同组别小鼠肺脏组织细菌载量
图5：对照组肺脏组织
肺脏组织的被膜结构清晰；肺脏实质为肺内支气管各级分支及其终末的大量肺泡，灶性肺泡壁轻度增厚（黑色箭头），肺泡间隔增宽；各级支气管结构无明显异常；少量血管周围结缔组织排列疏松（橙色箭头）；少量血管淤血（绿色箭头）；未见明显的炎性细胞浸润。
图6：1*108CFU/只感染组肺脏组织
肺脏组织的被膜结构清晰；肺泡壁薄，大范围肺泡上皮细胞坏死（黑色箭头），胞核溶解，胞质嗜酸性增强；肺泡腔内广泛可见以巨噬细胞、淋巴细胞及粒细胞为主的炎性细胞渗出（蓝色箭头），并可见坏死细胞碎片及少量嗜酸性物散在分布（红色箭头），少量肺泡扩张（灰色箭头），体积增大；大量支气管及细支气管腔内可见炎性细胞渗出及坏死细胞碎片（橙色箭头）；此外，细支气管及肺泡腔内可见大量的蓝紫色点状物细菌聚集（黄色箭头）；组织内可见大量的出血灶（棕色箭头），肺泡腔、细支气管及血管周围可见多量的红细胞；多见肺泡壁毛细血管淤血（紫色箭头）；少量血管淤血（绿色箭头）。
肺炎克雷伯菌小鼠LD50为6.9*106 CFU/只，滴鼻攻毒后D2-D3小鼠症状最明显，体重下降严重，陆续出现死亡，小鼠经过头孢氨苄治疗后状况优于未治疗组；由于菌株毒力较强，攻毒低剂量组存活率高于高剂量组。
小鼠肺部组织HE显示肺炎克雷伯菌感染肺部，导致以巨噬细胞、淋巴细胞及粒细胞为主的炎性细胞渗出，大量支气管及细支气管腔内可见炎性细胞渗出及坏死细胞碎片，细支气管及肺泡腔内可见大量的蓝紫色点状物细菌聚集。
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