苄嘧磺隆降解菌株75B的生长曲线、生长及降解（一）
苄嘧磺隆是一种磺酰脲类除草剂，被广泛应用于稻田土壤中防除一年生和多年生阔叶杂草。在土壤中的持效期较长，大量施用后易对后茬敏感作物产生药害，微生物降解是土壤中苄嘧磺隆转化的主要方式。本研究从长期施用该除草剂的稻田土壤中分离筛选到1株苄嘧磺隆降解菌株75B，经形态学及生理生化特征、16S rRNA基因扩增测序构建系统发育树分析，鉴定为Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。75B菌株对环境的适应能力较强，在pH 5.09.0、0.55.0%NaCl浓度下、培养温度为2638℃的范围内生长良好。将该菌株按5%接种量置于pH 7.0、以苄嘧磺隆为唯一碳源的无机盐培养基(2.0%NaCl浓度)中、34℃条件下培养，对50 mg/L苄嘧磺隆的5 d降解率为74.11%，培养至10 d时的降解率为97.65%。结果表明75B菌株可以有效地降解苄嘧磺隆，具有应用于该除草剂污染环境修复的潜力。
苄嘧磺隆(Bensulfuron-methyl，BSM)是一种磺酰脲类除草剂，可以抑制乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)的活性，导致植物支链氨基酸的合成受阻而起杀草作用。由于其选择性高，对禾本科植物无害，因而被广泛应用于稻田土壤中防除一年生和多年生阔叶杂草和莎草。苄嘧磺隆具有挥发性低、难以光降解，在碱性土壤中的持效期长达100 d以上的特征。大量应用后不仅对后茬轮作作物有毒、损伤烟草和番茄等敏感作物，而且其残留可通过渗滤增加邻近水生环境污染的可能性。研究已经证明BSM对水生蕨类和淡水蓝藻有高度毒性。较高浓度(3.553 mg/kg)BSM的处理可造成土壤微生物多样性降低，严重抑制需氧性细菌、固氮菌、纤维素分解菌及氨化细菌的生长，减少了土壤固氮过程和硝化作用的进行；还可导致Pseudomonasputida(恶臭假单胞菌)的急性毒性效应。然而，利用14C标记技术对施加苄嘧磺隆的稻田土壤进行降解研究，发现重复施用BSM的稻田土壤中矿化产生14CO2的速率更快，表明土壤细菌可以利用BSM为碳源和能源；显然，通过微生物酶系统发挥的微生物降解仍然是苄嘧磺隆在土壤中转化的决定性机制。但是，自2005年首次分离到可以降解苄嘧磺隆的Brevibacteriumsp.BH菌株后，近年来苄嘧磺隆的降解微生物报道仍较少。
为了丰富苄嘧磺隆的降解菌株，本研究从长期施用苄嘧磺隆除草剂的农田土壤中，分离筛选到1株Klebsiellapneumoniae，并对其生长降解特性进行了研究，以期为苄嘧磺隆污染土壤的生物修复提供理论依据和菌种资源。
1材料与方法
1.1土样采集
采集土样来自贵州省贵阳市花溪区常年施用野老除草剂(含苄嘧磺隆6%，乙草胺16.7%)的稻田淹水土壤(北纬N26°26′18.23″，东经E106°39′45.32″，海拔1 125.35 m)，土壤为黄壤、pH值6.0。
1.2培养基
基础盐培养基(minimal sodium medium，MSM)：NH4NO31.0 g，NaCl 1.0 g，MgSO40.1 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121℃灭菌30 min。
LB培养基：酵母膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0，121℃灭菌30 min。
固体培养基均加入2.0%琼脂。
1.3主要试剂及仪器
主要试剂：苄嘧磺隆标品(Sigma-Aldrich，USA)，10%苄嘧磺隆原药(安徽华星化工股份有限公司)，除乙腈和甲醇为色谱纯外，其余试剂均为国产分析纯；分子生物学试剂Premix rTaq购自TakaRa，Bacterial DNA Kit购自Omega；主要仪器为T100 PCR仪(Bio-Rad，USA)，Chemi Doc XRS+凝胶成像仪(Bio-Rad，USA)，Waters 600高效液相色谱系统(Waters，USA)。
引物合成及产物测序均由上海英骏生物工程有限公司完成。
1.4苄嘧磺隆降解菌的分离
称取土壤10.0 g加入100 mL含10 mg/L苄嘧磺隆的无机盐培养基中，于30℃恒温振荡培养器中150 rpm振荡培养，每隔10 d转接一次，逐步提高培养基中的苄嘧磺隆浓度，连续驯化、富集培养6次，直至苄嘧磺隆浓度为250 mg/L。取最后一次富集培养液适量，稀释后涂布培养于含50 mg/L苄嘧磺隆的MSM固体培养基上，30℃培养4 d左右，挑选生长良好的菌落进行分离纯化并保种。
1.5苄嘧磺隆降解菌株的鉴定
1.5.1降解菌株的形态及生理生化鉴定纯化的单菌落接种到LB固体培养基中活化两次后观察菌落形态，挑取少量单菌落涂片进行Gram染色后光学显微镜观察。生理生化的鉴定依照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》进行。
1.5.2降解菌株的分子鉴定利用Bacterial DNA Kit提取细菌DNA，以降解菌DNA为模板，利用细菌16S rRNA基因扩增的通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)、1492r(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，有目的大小条带者送出测序。测序获得的16S r RNA基因序列使用BLAST进行同源性比较，同时联合EzTaxon-e服务器的模式种细菌菌株比对进行分子鉴定。利用MEGA6.0中的邻近法(Neighbor-Joining)构建系统发育树，进行1 000次自展检验。
1.6不同环境因素对苄嘧磺隆降解菌株生长的影响
1.6.1降解菌株的生长曲线将活化菌液分别接种于LB培养基和含50 mg/L苄嘧磺隆的LB培养基中，使得培养液起始OD600值为0.2左右，于30℃150 rpm振荡培养，定时取样测定菌体生长量。
1.6.2培养基不同pH值对降解菌株生长的影响将活化菌液接种于60 mL含50 mg/L苄嘧磺隆的LB培养基中，调节培养基pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，于30℃150 rpm振荡培养，定时取样测定OD600值。
1.6.3培养基中不同NaCl浓度对降解菌株生长的影响在含50 mg/L苄嘧磺隆的60 mL LB培养基中(原有NaCl浓度为0.5%)，分别添加NaCl使其盐浓度分别为1.0、2.0和5.0%，接种菌液于30℃振荡培养并测定OD600值。
1.6.4不同接种量对降解菌株生长的影响将活化的菌液调节OD600值为1.0，按1.0、5.0、7.0和10.0%的接种量分别转接入含50 mg/L苄嘧磺隆的60 mL LB培养基中，于30℃振荡培养并测定OD600值。
1.6.5不同装液量对降解菌生长的影响分别取20、40和60 LB培养基(含50 mg/L苄嘧磺隆)装入100 mL三角瓶中，接入菌液于30℃振荡培养并测定OD600值。
1.6.6不同培养温度对降解菌生长的影响将活化菌液转接入60 mL LB培养基(含50 mg/L苄嘧磺隆)中，分别在26、30、34和38℃条件下振荡培养并测定OD600值。以上每个处理均设三个重复。
1.7降解菌株在以苄嘧磺隆为唯一碳源培养基中的生长及降解
将活化菌液6000 rpm离心5 min后弃上清，菌体沉淀用MSM培养液洗涤2次后重悬。重悬菌液分别接种于含50、100和150 mg/L苄嘧磺隆的MSM培养基中，在最适生长条件下置于恒温摇床中150 rpm振荡培养，定时取样测定OD600值。每个处理设三个重复。选择菌体生长较好的培养液处理后，HPLC测定其中的苄嘧磺隆浓度并计算降解率。
培养液中苄嘧磺隆的提取及浓度测定参考李阳阳方法，简而言之，取适量培养液加入3倍体积的二氯甲烷萃取、无水硫酸钠吸去水分，经旋转蒸发仪蒸干后加入色谱级甲醇溶解、过滤后利用HPLC测定培养液中的苄嘧磺隆含量。HPLC测定的色谱柱为AsilentTC-C18柱，以甲醇为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长为210 nm。
1.8数据处理
试验数据处理采用Excel 2010和SPSS19.0软件，多重比较采用LSD法。