水貂李氏杆菌的分离鉴定、生化试验、药敏实验、毒力试验—

水貂李氏杆菌的分离鉴定、生化试验、药敏实验、毒力试验——材料与方法

来源：山东畜牧兽医发布时间:2025-04-17 17:52:15 浏览：15 次

山东日照某水貂养殖场发生神经症状为主要特征的疾病，发病率较少，主要表现为食欲减退、瘫痪、有的转圈，开始未引起注意，慢慢开始增多，按照维生素B1缺乏治疗，未见效果，后来发展到神经症状伴随下痢、呕吐、腹泻，最后死亡。畜主带病死水貂来实验室检测，经细菌分离检测、生化试验、PCR基因扩增确诊为李氏杆菌，通过药敏试验选择敏感性高的药物治疗，最终控制了病情。李氏杆菌在水貂上发病较少，都是散发，一般不被重视，有的仅仅作为神经性脑炎治疗，现就这次李氏杆菌的分离鉴定介绍如下。

李氏杆菌可以感染多种畜、禽、野生动物和人，是一种严重的人畜共患传染病，引起多种动物的流产、败血症、脑膜脑炎等临床特征，在食品安全上有重要性，李氏杆菌属的代表是单核细胞增多性李氏杆菌，该菌是人和动物李氏杆菌病的病原体，是致死性食源性条件致病菌。李氏杆菌寄生在多种冷血动物蜱、蝇、昆虫、鱼虾和甲壳动物体内，环境中广泛存在于江河湖、沼泽污泥、屠宰废弃物、饲草、垫料、肉奶蛋以及水产品中。土壤污染和摄入被污染的饲料是李氏杆菌的主要传播媒介，青贮饲料pH值高于5.5加快李氏杆菌的繁殖，是该病传播的主要方式，被称为“青贮病”。李氏杆菌病在不同动物上症状不同，在禽类和啮齿类发病主要症状是坏死性肝炎和心肌炎，单蹄兽上发病主要是呈现败血症，反刍兽和人类发病主要是脑炎型和流产，水貂、狐狸貉子多种毛皮动物容易患该病，主要是神经症状。李氏杆菌是革兰氏阳性无芽孢小杆菌，大小0.4~0.5µm×1~2µm，常呈现V形排列，血琼脂平板培养呈现明显的溶血环菌落。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验菌株养殖场水貂发生疾病，主要是神经症状，解剖从病死貂脑内分离到一株细菌，进行一系列实验。

1.1.2试验动物18~22g小白鼠，购自山东大学实验动物中心；1.5~2kg家兔，购自济南西岭角养殖繁育中心；1~2月龄水貂，购自济南章丘航科特种毛皮动物养殖场。

1.1.3试验材料药敏片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；微量生化反应小管，购自北京陆桥技术有限责任公司；营养琼脂、麦康凯琼脂、SS琼脂，购自青岛海博生物技术有限公司；牛血清，购自内蒙古金源康生物工程有限公司；犬瘟热病毒抗原快速检测试纸，购自韩国百易奥生物公司；解剖台、剪刀、手术刀、酒精灯、载玻片、接种环、试管，实验室常备物品。

1.1.4试验器具生物安全柜，苏净安泰BSC-1600IIA2；显微镜，奥林巴斯CX-31；全自动样品快速研磨仪，上海净信科技Tiss-24；基因扩增仪，杭州博日科技有限公司TC-96/G/H(b)c；恒温培养箱，三洋MCO-15AC。

1.2方法

1.2.1细菌的分离培养与镜检

将发病死亡水貂外表消毒，放解剖台解剖，无菌取心血、肝脏、肺脏、脑组织进行载玻片涂片、染色、镜检，细菌分离时接种营养琼脂平板、麦康凯琼脂平板、SS琼脂平板、10%血清营养琼脂平板、10%兔鲜血琼脂平板，37℃温箱培养24h，观察细菌生长情况。

1.2.2细菌的生化试验

无菌取10%血清营养琼脂平板上生长的菌落，接种10%血清马丁肉汤培养基，接种后37℃温箱培养24h，取样接种各种生化反应小管，观察是否发酵发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、鼠李糖、海藻糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、棉实糖、糊精、水杨苷、卫矛醇，进行甲基红MR和VP试验，观察是否反应，接种后第三天观察反应结果，有的菌缓慢发酵糖类，留样继续观察至第7天，记录结果。

1.2.3细菌的16S rRNA分子生物学鉴定

病死水貂脑组织细菌分离，接种10%血清营养琼脂平板，37℃温箱培养24h，取菌落接种马丁肉汤37℃温箱培养18h，取1ml放入1.5ml无菌的离心管中，12000r/min离心1min，弃掉上清，加入无菌水中将菌体重悬，使用振荡器震荡摇匀，沸水浴7min，再冰浴5min，12000r/min离心1min，上清液作为基因扩增的模板。设计寡核苷酸引物来扩增16S rRNA，使用引物如下：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,R1-5’ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’。PCR反应体系50µl：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500mmol/L)5µl，2.5mmol/L dNTP 4µl，引物(20umol/L)各1µl，模板2µl，ddH2O36.8µl，Taq酶(5U/ul)0.25µl。PCR反应条件：94℃5min；94℃1min，56℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。取PCR产物5µl用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物送交上海基因测序公司进行测序。提交Genbank进行对比，构建系统发育树，判定细菌的系统发育地位，16S rRNA以相似性97%为界限，以高于97%判定为该菌。

1.2.4病料PCR检测

由于水貂发病主要是神经症状，怀疑腺病毒、狂犬病毒、伪狂犬病毒一些病毒引起的疾病。无菌取肝、脾脏、脑组织研磨，进行基因扩增，检测是否存在腺病毒、狂犬病毒、伪狂犬病毒。

1.2.5犬瘟热试纸检测

使用犬瘟热抗原快速检测试纸商品试纸盒内的棉签，取鼻液、气管液、肺部血液在稀释液中稀释，滴于检测孔内，待稀释液流到检测区1min后，观察结果，C为对照，T为检测，C出现红色线为试纸合格，可进一步判定，T线出现红色为犬瘟热阳性，T线无色为犬瘟热阴性。

1.2.6细菌的药敏试验

按照药敏纸片法进行药敏试验，将分离菌均匀涂抹在10%血清营养琼脂平板，把相应的头孢喹肟、头孢噻呋、头孢曲松、左氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、阿奇霉素、丁胺卡那霉素、壮观霉素、强力霉素、多黏菌素、林可霉素药敏片贴在平板上，37℃温箱培养24h，观察记录抑菌圈的大小。

1.2.7细菌的毒力试验

病死水貂脑组织细菌分离，接种10%血清营养琼脂平板，37℃温箱培养24h，取菌落接种马丁肉汤37℃温箱培养18h，培养液腹腔注射18~22g小白鼠，0.5ml/只；将菌液接种1.5~2kg家兔眼睛结膜内，1ml/只；将菌液肌肉注射1~2月龄水貂，1ml/只，接种注射后连同对照组观察7d。

水貂李氏杆菌的分离鉴定、生化试验、药敏实验、毒力试验——材料与方法

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