红螯螯虾源布氏柠檬酸杆菌分离鉴定和耐药性分析（一）
布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)属于柠檬杆菌属，为人和动物体内常见菌群，是一种条件性致病菌。在机体免疫力降低时，布氏柠檬酸杆菌可以感染包括人在内的多种生物，常引起患者呕吐、腹泻和高烧，严重者会引起胆囊炎或者急性腹膜炎。患病虾类则出现活动力差、螯足无力、食欲下降和应激迟缓，并伴有头甲下大量腹水和肝胰腺肿大等。近年来，人类感染布氏柠檬酸杆菌的相关报道越来越多，但罕见从红螯螯虾中分离到布氏柠檬酸杆菌的相关报道。本试验于2021年1月，自红螯螯虾肠道内分离获得形态大小一致的菌落，采用形态学观察、生化鉴定、16S rDNA测序和系统进化分析对分离菌株进行鉴定，通过人工感染斑马鱼确定其致病性，以Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法进行药物敏感性试验确定其耐药性，以期为红螯螯虾布氏柠檬酸杆菌感染的诊断和治疗提供基础资料。
1材料与方法
1.1病原材料来源
广西壮族自治区南宁市吴圩镇红螯螯虾养殖场内活动力差、螯足无力、食欲下降的红螯螯虾(采样地点东经108.152 45°、北纬22.584 52°)。
1.2主要试剂
硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(Thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS琼脂培养基)、LB液体培养基和MH液体培养基，均购自青岛海博生物技术有限公司;细菌总DNA提取试剂盒和PCR扩增试剂盒，均购自北京康润诚业生物科技有限公司;16S rDNA通用引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;微量生化鉴定管，购自杭州微生物试剂有限公司;药敏纸片，购自常德比克曼生物有限公司。
1.3主要仪器
振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司;生物显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司;台式高速冷冻离心机，湘潭湘仪仪器有限公司;聚合酶链反应核酸扩增仪，伯乐生命医学产品(上海)有限公司;紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司。
1.4细菌的分离和纯化
在无菌环境下操作，先用生理盐水冲洗红螯螯虾体表，再用乙醇擦拭，对红螯螯虾进行检剖。取红螯螯虾肠道内容物至装有少量0.9%生理盐水的无菌EP管中，将肠道内容物进行10倍梯度稀释，取10μL各梯度稀释液，用涂布器均匀涂于TCBS琼脂培养基上，于30℃恒温倒置培养24 h。根据菌落形态挑取优势单菌落进行纯化培养，经2次以上纯化培养，挑取单菌落接种于LB液体培养基，于36℃过夜培养，将菌液和甘油按2∶1体积比混匀，-80℃保存备用。
1.5细菌的鉴定
菌落形态观察:取纯化后的分离菌株划线接种于TCBS琼脂培养基，于36℃静置培养12 h，观察并记录单菌落的形状、大小、边缘、表面和隆起形状等表型特征。纯化后的单菌落经LB液体培养基扩大培养后进行革兰染色，置于光学显微镜下观察分离菌株的染色特征。
生化鉴定:取纯化后的分离菌株于0.9%生理盐水中稀释，至0.5麦氏比浊度的菌悬液，取10μL菌悬液加至微量生化鉴定管中，并按照说明书操作进行生化鉴定。
16S rDNA鉴定:使用细菌总DNA提取试剂盒提取纯化后分离菌株的总DNA，以16S rDNA通用引物27 F和1492 R进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)鉴定。PCR阳性产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将序列上传至NCBI进行Blast比对分析，通过MEGA X软件以最大似然法(Maximum likelihood method，ML)构建系统进化树。
菌株生长曲线:取纯化后的分离菌株至LB液体培养基中，于36℃培养，每隔1 h取适量菌液，于600 nm处使用分光光度计检测光密度(Optical density，OD)值，连续检测38 h，并以时间为横坐标，OD600 nm值为纵坐标，绘制生长曲线。
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