Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白单独及联合暴露对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的毒性作用（二）
1.2.4急性毒性实验
在超净无菌工作台内将-20℃保存的Vibrio fisch⁃eri冻干粉西林瓶打开，取复苏液1 mL于室温下平衡复苏10 min，振荡摇匀。吸取发光菌液1 mL，用2%NaCl稀释至40 mL。将不同浓度样品（Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白和复合体系）溶液放在96孔板中，不同物质每个浓度设置3个平行，第一行设置为阴性质控（2%NaCl），为初始发光强度，第二行为阳性质控（10 mg∙L-1的ZnSO4溶液），为样品发光强度。各孔中加入样品液180μL和发光菌液20μL，总体积200μL，15 min后放入检测仪测定发光强度。根据Vibrio fischeri的荧光强度计算抑制率（RI，%），计算公式如下：
R1=(C0-St)/C0*100%
式中：C0为阴性质控初始发光强度；St为t时样品的发光强度。
1.3数据处理
每个实验设置3个重复，采用SPSS 22进行分析，采用单因素方差分析（ANOVA）和最小显著性差异（LSD）检验差异的显著性，采用Origin 9绘图。
2结果与讨论
2.1不同浓度Zn2+、Cd2+对细菌生长曲线的影响
重金属对细菌生长会产生抑制作用，浓度愈高抑制作用愈强。Zn2+、Cd2+浓度增加对B.subtilis和E.coli的抑制增强（图1），E.coli细胞壁具有带负电荷的脂多糖，其可与更多的金属阳离子结合，B.subtilis耐性强于E.coli。不同金属对生物体的毒性不同，Cd2+对B.subtilis和E.coli生长的抑制作用大于Zn2+。Cd是强毒性元素，低浓度就有很强的毒性；Zn是生物体必需元素，低浓度Zn可保护细胞免受伤害。Zn2+和Cd2+的加入均对两种细菌产生了不同程度的毒害，如图1所示，Cd2+对两种细菌的生长抑制效果强于Zn2+。不同浓度的Zn2+和Cd2+胁迫培养细菌生长0~24 h时，OD值均低于对照组。随着金属浓度的增加，0~11 h为B.subtilis的生长期，此时生长曲线呈快速生长趋势，吸光值增大，12~15 h处于稳定期，15 h以后OD值减弱，此时为衰亡期。Zn2+和Cd2+浓度分别在20μg∙mL-1和8μg∙mL-1时完全抑制E.coli生长。
图1不同浓度Zn2+、Cd2+对细菌生长曲线的影响
2.2 Cry1Ac蛋白及其与Zn2+、Cd2+联合暴露对细菌生长曲线的影响
图2为Cry1Ac蛋白及其与Zn2+、Cd2+联合暴露条件下的细菌生长曲线。
在0~16 h，各处理组细菌生长曲线的OD600值均低于对照组。在0~10 h内细菌处于生长期，Cry1Ac蛋白和Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac联合暴露对B.subtilis和E.coli生长产生抑制，且随浓度增加细菌生长受到的抑制作用增强，且E.coli比B.subtilis更为敏感。Cd2+单独及复合体系对两种细菌的毒性明显强于Zn2+单独及其复合体系，Zn在短期内的毒性可能与生物体内贮存浓度有关，当Zn在生物体内积累到一定浓度就会启动金属硫蛋白，促使其与金属硫蛋白结合而降低毒性。同时Zn2+和Cd2+都会与Cry1Ac蛋白结合，从而减轻重金属对细菌的毒害。
2.3 Cry1Ac蛋白及其与Zn2+、Cd2+联合暴露下菌落平板生长状况观察
采用平板计数法检测Zn2+、Cd2+及Cry1Ac蛋白联合暴露时对E.coli和B.subtilis存活的影响，结果如图3所示。随着重金属浓度的增加，细菌的存活率显著降低（P<0.05）。重金属会抑制细菌酶活性及其生长，高浓度重金属甚至会导致细菌死亡。Cd2+浓度为10μg∙mL-1时E.coli和B.subtilis的存活率均为0，表明Cd2+浓度为10μg∙mL-1时对两种细菌的抑制率达到最大。当Zn2+浓度为16μg∙mL-1时，E.coli的存活率为0，Zn2+浓度为20μg∙mL-1时，B.subtilis的存活率为0，表明Zn2+浓度为16、20μg∙mL-1时分别对两种细菌抑制率达到最大。当Zn2+-Cry1Ac的浓度为4μg∙mL-1时，对E.coli和B.subtilis的存活率分别为74.7%和76.8%，当Cd2+-Cry1Ac浓度为4μg∙mL-1时，E.coli和B.subtilis的存活率分别为66.1%和71.2%，即Cd2+-Cry1Ac对两种细菌生长的抑制效果强于Zn2+-Cry1Ac。
图3不同浓度Zn2+、Cd2+及其与Cry1Ac蛋白联合处理的细菌存活菌落电镜图