朱鹮细胞系的建立、体外生长特征、性染色体的荧光原位杂交鉴定（二）
1.3细胞生长评价
参照Mosmann(1983)的方法,测定5、10、20和25代的细胞生长率。细胞按1×104个/mL密度接种于96孔培养板内,每孔接种180μL。37°C培养24 h后,每孔加入20μL浓度为5 mg/mL的MTT[3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,3-(4,5)-dimethylthiazol(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,Sigma],重复做5个孔。继续培养4 h,小心吸出上清,每孔加入150μL的DMSO,10 min后,于振荡器上振摇10 min,并在酶标仪(BIORAD-680)上测定570 nm波长下的吸光度值(optical density value,OD)。以后每天按此方法测定5孔细胞的OD值,连续测定7 d。以培养时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞的生长曲线。
1.4免疫荧光染色法鉴定细胞来源
将对数生长期的细胞接种到置于6孔板内,且已灭菌的7 mm×22 mm盖玻片上,培养24 h后吸去培养液,用冰冷的PBS漂洗3次;4%的多聚甲醛室温下固定细胞15 min,用含0.03%Triton-100的PBS(PBST)漂洗3次,每次5 min;加入1%BSA(bovine serum albumin,牛血清白蛋白,Amresco)室温封闭20 min,PBS漂洗3次,每次5 min;分别加鼠抗人波形蛋白和鼠抗人平滑肌α-actin(肌动蛋白)单克隆抗体(1:200,Dako),4°C孵育过夜;PBS漂洗细胞3次,每次3 min,加入Cy3标记的羊抗鼠IgG二抗,37°C孵育30 min;PBST漂洗3次,每次5 min,用含DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚,4',6-diamidino-2-phenylindole,Sigma)的封片液封片后,荧光显微镜下观察并照相。
1.5细胞遗传学分析
1.5.1染色体标本制备在细胞对数生长期,每10 mL培养液加入20μL秋水仙素(100μg/mL,Sigma),处理细胞60 min后弃去培养液;用0.25%胰酶消化细胞1～2 min,然后加入适量的生长液抑制胰酶作用;混匀细胞悬液,离心后弃上清,用0.075 mol/L KCl溶液低渗处理细胞15 min,离心后加入甲醇:冰乙酸(3:1)固定细胞3次;以空气干燥法制片。
1.5.2染色体带型分析
参照Seabright(1971),Summer(1972)和Goodpasture&Bloom(1975)的方法进行G带、C带和Ag带显示。
1.5.3荧光原位杂交参照Nie et al(2009)的方法,利用石鸻(Burhinus oedicnemus,鸻形目)的Z和W染色体特异探针与朱鹮的中期染色体进行荧光原位杂交,鉴别朱鹮的性染色体。
1.6图像拍摄与分析
用装有CCD摄像装置的蔡司荧光显微镜(Axioplan 2,Zeiss company)和图像分析软件(CytoVision system,Applied Imaging Corp,UK)进行图像拍摄和分析。
2结果与讨论
2.1朱鹮皮肤细胞系的建立
在陕西朱鹮人工繁殖中心获得两只朱鹮(雌、雄各一只)的皮肤样品后,置于运输液中运送到昆明。原代培养15 d后,有细胞从组织块周围长出(图1 A),继续培养5 d后细胞长成致密单层(图1 B),即可以1:2的比例进行传代培养,以维持细胞增殖。我们对10代以前不同代数的细胞进行冷冻保存,成功建立了两株朱鹮细胞系,分别命名为KCB 201253S（雄性)和KCB 2012055S（雌性)。细胞均为典型的成纤维样细胞,且支原体污染检测（荧光法)结果均为阴性。冻存的朱鹮细胞在复苏后能够正常生长,且生长速度与冻存前相比并未减低。
图1培养的朱鹮细胞形态
为优化培养条件,我们选用了不同的培养基如DMEM、MEM和OPTI-MEM(GIBCO)同时培养朱鹮细胞,并添加相同比例牛血清,经比较发现OPTI-MEM培养基最适宜朱鹮细胞的生长。
为鉴别所建立的朱鹮细胞系的来源,我们采用免疫荧光染色的方法,用两种不同的抗体对培养的朱鹮细胞进行免疫抗体染色。结果显示在朱鹮细胞中鼠抗人波形蛋白抗体染色为阴性,而鼠抗人平滑肌α-actin抗体染色为强阳性(图2,呈束状的红色荧光显示肌丝特征)。鼠抗人平滑肌α-actin抗体只与血管平滑肌细胞中的actin的α异构体特异性结合,而与成纤维细胞中的β-、γ-actin均不能结合。因此该抗体可以作为血管平滑肌细胞的鉴定(Cai et al,2005)。免疫荧光染色的结果提示我们建立的朱鹮细胞系来源于血管平滑肌组织。体外培养细胞源于动物机体,而机体内的细胞都混杂生长,每一种组织都有血管和间叶组织,因此,由动物体来源的培养材料而进行的原代培养,绝大多数都呈各种细胞混合生长（Zhou,2006)。我们所取的朱鹮皮肤样品中也含有血管,在剪小的组织块中包含有血管平滑肌组织,在原代培养时包括血管平滑肌细胞在内的各类细胞均可从组织块中长出,因此,可能在后续的传代培养过程中,血管平滑肌细胞成为优势细胞而保留下来。
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