产脂肪酶地衣芽孢杆菌LD-1302筛选、培养基及产酶条件研究（一）
从海南热带海水中分离筛选得到10株产脂肪酶菌，其中菌株LD-1302产脂肪酶活性最高。根据16S rDNA序列分析和生理生化试验结果，鉴定该菌为地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。对该菌株的产酶条件进行优化，在pH 8、温度37℃、盐度32的条件下，经橄榄油诱导，起始浓度为3.75×105CFU/mL的LD-1302摇瓶发酵48 h时产脂肪酶活最高，脂肪酶活可达（34.97±1.45）U/mL。
海南管辖海洋面积200多万km2，海洋资源丰富；不过，当前海水养殖产生的含大量残饵、动物残体的养殖废水及其它来源油脂性污水的任意排放，造成了该海区海洋环境的存在脂肪污染，严重影响当地海洋生态环境的健康（周永灿等，2013；Nejidat，2005）。因此，安全有效清除海南热带水产养殖和海洋环境中的脂肪是热带海洋生态环境修复和可持续利用的重要前提。脂肪酶是催化长链脂肪酸甘油酯水解和合成的羧酸酯酶，广泛存在于动植物和微生物，其中以微生物脂肪酶资源最为丰富；因其广泛的底物特异性、在有机溶剂中稳定性好、易于大规模生产及纯化等优点而成为当代酶工业最受瞩目的酶种之一（李鑫玲等，2011；彭立凤等，2006；闫云君等，2006），也是环境中脂肪降解的主要原动力。
海南为我国唯一的热带沿海地区，在长期自然进化过程中，海南地区形成了独特的微生物群落结构，存在丰富的产脂肪酶芽孢杆菌资源，为安全解决海南热带水产养殖和海洋环境中脂肪污染问题奠定了重要基础（朱彦博，2013；吴海武，2014）。不过，有关产脂肪酶芽孢杆菌的海南土著菌种的相关研究迄今尚未见报道。为此，本文试图从海南热带海洋环境中筛选产脂肪酶芽孢杆菌并阐述其产酶条件，这对于应用脂肪酶生物技术处理被油脂污染的热带海洋水体特别是热带养殖水体以及可持续发展热带海洋经济具有重大意义。
1材料与方法
1.1材料
样品：从海南省乐东县球港、陵水县新村港、东方市板桥和三亚市南山等地的热带海水养殖环境中采集10份水样。
主要试剂：蛋白胨、橄榄油（主要脂肪酸链长为C16-C18）、椰子油（主要脂肪酸链长为C8-C20）、葵花籽油（主要脂肪酸链长为C16-C22）、聚乙烯醇、蔗糖、4%聚乙烯醇（PVA）溶液、1 mg/mL罗丹明B溶液和橄榄油乳化液（4%PVA溶液：橄榄油=3:1，v/v）。
主要仪器：PCR仪；冷冻离心机；食品匀浆机；微生物快速立体计数仪；倒置荧光相差微分数码显微镜。
1.2培养基
改良富集液体培养基：（NH4）2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，橄榄油乳化液100 mL/L，灭菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃灭菌20 min。
改良罗丹明B显色初筛培养基：（NH4）2SO42g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，琼脂15 g/L，橄榄油乳化液100 mL/L，灭菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃灭菌20 min；灭菌后冷却至60℃加入6 mL罗丹明B溶液。
改良复筛固体培养基：蛋白胨10 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，橄榄油乳化液100 mL/L，琼脂15 g/L，灭菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃灭菌20 min。
生长培养基：（NH4）2SO42 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO41 g/L，蛋白胨5 g/L，橄榄油乳化液100 mL/L，灭菌海水定容至1 L，pH 7.0，121℃灭菌20 min。
计数固体培养基：蛋白胨10 g/L，酵母膏5g/L，琼脂15g/L，灭菌海水1L，pH7.0，121℃灭菌20min。
改良产酶发酵培养基：蛋白胨10g/L，（NH4）2SO41 g/L，K2HPO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，橄榄油10g/L，pH7.0，灭菌海水定容至1L，pH7.0，121℃灭菌20 min。
1.3产脂肪酶菌株的筛选
吸取10mL水样至100mL灭菌海水中，180r/min、30℃振荡10 min；并在80℃下水浴15 min，取出、静置。吸取10 mL上清菌液至100 mL富集液体培养基中，在180 r/min、30℃下培养。2 d后，吸取5 mL富集培养菌液至100 mL新鲜的富集液体培养基中，进行二次富集，如此连续富集培养3次。吸取1 mL第3次富集培养菌液至9 mL灭菌海水中，依次倍比稀释至10-4；吸取100μL稀释度为10-4的菌液在罗丹明B显色初筛培养基上涂布，挑选在罗丹明B显色初筛培养基上水解圈较大且在350 nm紫外灯下橙黄色荧光亮斑较大的菌落为筛选分离菌株。挑取菌落继续于罗丹明B显色初筛培养基上重复3次划线分离培养，直到菌落形态一致。挑取罗丹明B显色初筛培养基上的单菌落至复筛固体培养基上重复划线培养，直至单菌落不再染上罗丹明B显色剂。挑选在复筛固体培养基上的单菌落至改良产酶发酵培养基中，于200 r/min、30℃下振荡培养48 h，测定筛选得到菌株的产脂肪酶活性，以最优产脂肪酶活性的菌株为目的菌株。
产脂肪酶地衣芽孢杆菌LD-1302筛选、培养基及产酶条件研究（一）
产脂肪酶地衣芽孢杆菌LD-1302筛选、培养基及产酶条件研究（二）
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