磷浓度对海水钝顶螺旋藻生长和预采收的影响（一）
螺旋藻（Spirulina）或节旋藻（Arthrospira）为蓝藻门（Cyanophyta）、段殖藻目（Hormogonales）、颤藻科（Oscillatoriaceae）、螺旋藻属（Spirulina）或节旋藻属（Arthrospira）的藻类。螺旋藻是目前蛋白质含量最高的食品资源［1］，同时，螺旋藻还富含功能独特的活性多糖、藻蓝蛋白、γ-亚麻酸等生物活性物质，在食品、医药保健、化妆品及饲料等领域得以广泛应用［2］。研究表明，螺旋藻多糖对HIV病毒、丙肝病毒等多种病毒具有抑制作用［3］，而且其在抗肿瘤、抗氧化［4］、免疫调节、降血糖血脂以及修复DNA损伤等方面也表现出了良好的功效［5-6］。螺旋藻还含有丰富的藻蓝蛋白，藻蓝蛋白已被证实具有显著的抗癌、抗炎症等多种生物活性［7］，同时还能作为食用色素应用于食品行业［8］。γ-亚麻酸对心血管疾病具有良好预防作用，而且是合成前列腺素E1的前体物质［9］。
螺旋藻产业在国际上兴起于20世纪80年代初，我国于90年代中期已成为国际上最大的螺旋藻产业国［10］。利用天然海水培养螺旋藻，可显著节约淡水资源，同时可利用滩涂、盐碱地等环境进行培养，有效缓解农用耕地日趋紧张的问题，而海水中含有大量营养元素，可大幅度降低螺旋藻培养的肥料成本。长期以来，海水螺旋藻的研究得到全世界的普遍关注，但目前大多仅停留在实验室藻种选育阶段。本实验室于20世纪80年代末至90年代初在国际上率先建立了全海水的螺旋藻产业化生产技术，并与企业合作成功实现了海水螺旋藻的产业化，与传统淡水螺旋藻养殖相比，其品质得以显著提高［11-12］。
磷是调节细胞生长和代谢的必需营养因子之一，在大多数细胞过程中起着不可或缺的作用，特别是涉及能量转移、信号转导、高分子生物合成、光合作用和呼吸的过程［13］。研究表明磷元素对许多藻类脂质［14-15］、蛋白质［16］和多糖［17-18］的积累具有显著影响。螺旋藻的主要成分及其含量可以通过多种培养条件来控制，如氮浓度［19］、光照强度［20］和温度［21］。有关氮源、温度和光照对螺旋藻的生长、代谢产物影响研究十分广泛，但磷源浓度对螺旋藻生长代谢影响的研究还很少，仅见2篇文献对淡水螺旋藻的主要生化组分［22］和脂类积累［23］影响的研究。对于磷浓度对海水螺旋藻生物量生产和生化组成的影响，尚未见报道。因此，研究磷对海水螺旋藻生长和生化组成的影响对海水螺旋藻主要高值化产物生产以及海水螺旋藻产业具有重要的指导意义。本研究首次开展不同磷源浓度的海水螺旋藻培养实验，系统分析磷源浓度对海水螺旋藻生长及生化组成的影响规律，为通过磷调节来提高螺旋藻主要产物的产量、提升螺旋藻品质奠定理论基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1藻株及保存条件海水钝顶螺旋藻（Spirulina Platensis）藻种，由中国科学院南海海洋研究所海藻资源与生物技术实验室提供。
藻种保存条件：培养温度为25±1℃，荧光灯提供光源，培养光强为49-57μmol·photons m-2·s-1，光暗周期为12 h∶12 h。
1.1.2实验设计本实验以改良的Zarrouk海水培养基为基础培养基，其组成为：5 g/L NaHCO3，0.5 g/L NaNO3，0.01 g/L FeSO4·7H2O，0.08 g/L Na2EDTA，1 mL/L A5solution，以天然海水为基质配制而成。通过补加去离子水将盐度控制在28±1‰。K2HPO4·3H2O为磷源，加入不同的磷源浓度（终浓度分别为0.005、0.01、0.02，0.03和0.04 g/L），接种于500 mL锥形瓶，于温度为25℃，光强为49-57μmol·photons m-2·s-1条件下，静置培养，每天定时摇瓶6次。培养结束后（培养周期10 d），离心收集藻泥，去离子水多次清洗，真空冷冻干燥获得冻干粉，用于总糖、水溶性多糖、蛋白质、藻蓝蛋白、光合色素总脂以及脂肪酸含量的测定。
1.2方法
1.2.1生物质浓度的测定利用干重法进行测定。取一定量的藻液，用预先在80℃烘箱中烘干至恒重的混合纤维滤膜（0.45μm）进行抽滤，再将有藻细胞的滤膜放置在80℃烘箱烘至恒重，用减差法得到微藻细胞干重。每个样品重复3次计算平均值。
1.2.2总糖的提取及测定取10 mg藻粉，加入5 mL 0.5 mol/L H2SO4，于80℃水浴搅拌0.5 h，8 000 r/min离心10 min，收集上清液。反复抽提3次，合并上清后定容到50 mL，得到总糖提取液；总糖含量的测定采用苯酚-硫酸法［24］。
1.2.3水溶性多糖提取及测定取50 mg藻粉溶于水，超声破坏细胞结构后，70℃热水浸提4 h，8 000 r/min离心10 min收集上清。反复抽提4次，合并上清并定容至50 mL得到水溶性多糖提取液；水溶糖含量通过苯酚-硫酸法测定。
1.2.4胞壁多糖及总多糖的测定取上述提取水溶性多糖后所得藻渣，加入5 mL 0.5 mol/L H2SO4，于80℃水浴搅拌0.5 h，8 000 r/min离心10 min，收集上清液。反复抽提3次，合并上清后定容到50 mL，得到胞壁多糖提取液［25］；采用苯酚-硫酸法测定其含量。
1.2.5蛋白质含量的测定采用半自动凯氏定氮仪测定总蛋白质含量，以蛋白质的F值为6.25计算。
1.2.6藻胆蛋白的测定采用改良的Sigelman和Kycia法提取藻胆蛋白，分光光度法测定藻蓝蛋白、异藻蓝蛋白含量［26］。
1.2.7脂溶性光合色素测定取10 mg藻粉，置于10 mL玻璃离心管中，加入5 mL丙酮，避光冰浴搅拌提取1-2 d，直至藻体变白，3 000 r/min离心10 min收集上清得到色素提取液。采用分光光度法在662 nm、645 nm和470 nm下测定叶绿素a、总类胡萝卜素含量［27-28］，由下列公式计算：
色素含量（%DW）=（色素质量浓度算×提取液体积）/藻体干重
1.2.8总脂的测定与分级总脂的提取与含量的测定采取改良的Khozin-Goldberg方法［29］。
1.2.9脂肪酸组成的测定称取25 mg冻干藻粉于10 mL玻璃离心管中，加入2 mL 2%H2SO4无水甲醇：甲苯（9∶1，V∶V），充入氮气后，用80℃水溶搅拌1 h，再依次加入1 mL去离子水和1 mL正己烷，充分震荡后3 500 r/min离心5 min，将上层有机相转移至另一离心管中，氮气吹干，再加入1 mL含有C17标准品的正己烷，并用孔径为0.22μm的滤膜过滤至1.5 mL的小玻璃瓶中，最后利用气相色谱仪测定脂肪酸。
1.2.10统计分析数据以平均值，最后利用气相色谱SPSS13.0统计软件进行方差分析，检验水平仪=0.05，P＜0.05差异有统计学意义。使用Origin 8.1进行数据处理和图表制作。
相关新闻推荐
1、快速药敏检测方法、发展现状|拉曼光谱在RAST领域中的应用（二）