优化培养基配方减少无机硒对粗毛纤孔菌的抑制作用，同时提高富硒菌丝的产量（三）
2.2响应面法优化粗毛纤孔菌菌丝富硒培养基配方
2.2.1响应面试验结果及方差分析通过Design-Expert 8.06软件设计响应面试验,基于单因素结果,以麸皮(X1)、葡萄糖(X2)及硒(X3)为自变量,以粗毛纤孔菌菌丝生长速率平均值为响应值(Y),进行响应面试验,试验方案与结果见表2。通过Design-Expert 8.06对表2结果进行分析,得到的3因素与菌丝生长速度(Y)之间的回归模型可以表述为:
表2 BBD实验设计及结果
2.2.2各因素交互作用对粗毛纤孔菌菌丝生长速度的响应面分析为考虑交互作用对粗毛纤孔菌菌丝生长速度的影响,在另一因素条件固定不变(编码水平为零)的情况下,分析两两因素交互作用对其菌丝生长速度的影响。通过Design-Expert 8.06软件处理上述实验设计得到3D响应曲面图和等高线分析图(图5),可以直观地看出各个因子之间的交互作用对粗毛纤孔菌菌丝生长速度的影响。响应面分析中,等高线的形状可以反映两因素间交互作应对响应值影响的强弱大小,圆形表示不显著,椭圆形则与之相反;等高线的稀疏情况反映响应面图像的平陡情况。从图5可以看出,两两因素之间的等高线形状均为椭圆形,表明其交互作用显著。由图5A可知,粗毛纤孔菌菌丝生长速度(Y)随麸皮添加量(X1)和葡萄糖添加量(X2)的增加而增加;由图5B可见,粗毛纤孔菌菌丝生长速度(Y)随麸皮添加量(X1)的增加和硒添加量(X3)的减小而增加;在较小硒添加(X3)情况下,麸皮添加量(X1)
表3菌丝生长速度响应模型的方差分析
图5两两因素交互作用对粗毛纤孔菌菌丝生长速度影响的响应曲面图和等高线分析图
在很大的范围内均可取到较大的Y值;图5C也表现出与图5B相同的趋势,表明硒添加对粗毛纤孔菌菌丝生长不利,但可以通过其他因素与其交互作用减少其对粗毛纤孔菌菌丝生长抑制作用的影响。综合各图,各因素之间的交互作用与回归模型的方差分析结果相吻合。由Design-Expert 8.06软件分析得到最大响应值(Y)时最优培养基配方为:麸皮56.8 g/L、葡萄糖49 g/L、Se 22.4 mg/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L,此时富硒粗毛纤孔菌菌丝生长速度预测值为8.19 mm/d。
2.3验证实验
为了检测响应面结果的准确性,以改良PDA培养基为阴性对照,以等量硒添加改良PDA培养基为阳性对照,配制上述最优培养基配方进行富硒粗毛纤孔菌菌丝培养实验,每组八个重复,测得粗毛纤孔菌及富硒粗毛纤孔菌菌丝生长速度见图6。响应面优化培养基实测值8.41 mm/d>预测值8.19 mm/d>改良PDA实测值6.79 mm/d>等量硒添加改良PDA实测值 4.28 mm/d,且优化后的富硒培养基培养的粗毛纤孔菌菌丝的稠密度更高(图6)。与等量硒添加改良PDA相比,以响应面优化培养基进行培养,粗毛纤孔菌菌丝生长速度提高了0.965倍。此外,通过电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对最优培养基培养菌丝的硒富集量进行检测,测得富硒粗毛纤孔菌菌丝硒富集量为31.584μg/g。说明采用响应面法获得的模型能较好地预测富硒粗毛纤孔菌菌丝的生长情况,该富硒培养基配方可以减少外源硒对粗毛纤孔菌菌丝抑制作用的影响,使其能够在富硒的同时正常甚至更好地生长,提高富硒菌丝的产量,具有一定的实用价值。
图6验证实验结果
3结论
首次针对粗毛纤孔菌对无机硒的耐受度进行探索,发现该菌菌丝的生长情况受外源硒影响较大,当硒浓度达到或大于37.25 mg/L时,该菌菌丝生长受到显著的抑制作用(P<0.05)。因此,本研究通过响应面法对该菌富硒培养基成分进行优化,旨在保证该菌菌丝在正常生长情况下合理富集、积累并转化无机硒为有机硒,提高富硒粗毛纤孔菌菌丝的产量。
经响应面法优化得到富硒粗毛纤孔菌菌丝生长最优培养基配方为:麸皮56.8 g/L、葡萄糖49 g/L、Se 22.4 mg/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L。其中葡萄糖添加量、麸皮添加量和硒添加量对富硒粗毛纤孔菌菌丝生长均具有极显著作用;且麸皮与葡萄糖、麸皮与硒添加、葡萄糖与硒添加之间的两两交互作用对富硒粗毛纤孔菌菌丝生长均具有显著作用(P<0.01)。在此条件下,富硒粗毛纤孔菌实际菌丝生长速度达到8.41 mm/d,与预测值相符,且硒富集量达到31.584μg/g。说明采用响应面法优化获得的富硒粗毛纤孔菌菌丝生长培养基配方具有一定的实用价值。
该配方通过培养基内因素间的交互作用减少了外源硒对粗毛纤孔菌菌丝生长抑制作用的影响,确定了合理的硒添加比例,与等量硒添加改良PDA相比,优化后粗毛纤孔菌菌丝生长速度提高了约1倍(0.965倍);与同配方无硒添加培养基相比,菌丝硒含量增加为31.584μg/g。国际营养联合会规定缺硒人群每人每天食用硒量不少于50μg,每人每天食用本研究富硒粗毛纤孔菌制品1.58 g即可完全满足此要求。本研究在硒抑制与菌丝生长之间找到平衡点,获得了最优配方,为富硒粗毛纤孔菌菌丝体的大量制备、富硒粗毛纤孔菌子实体的栽培及其它后续研究提供了理论依据。
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