苄嘧磺隆降解菌株75B的生长曲线、生长及降解（二）
2结果与分析
2.1苄嘧磺隆降解菌株的分离与鉴定
利用长期使用野老除草剂的稻田土壤为材料，通过逐步提高培养基中苄嘧磺隆浓度的方法，经近两个月的驯化及富集培养，最终分离纯化获得1个细菌菌株，该菌株在含50 mg/L苄嘧磺隆的MSM固体培养基平板上生良好，命名为75B。
降解菌株75B在LB固体平板上培养24 h后，呈现出半透明、光滑、隆起的乳白色光泽感菌落；镜检为G-的杆状细菌(图1)。生理生化测试表明，该菌株M.R试验、V.P试验、氧化酶及过氧化氢酶阴性；苯丙氨酸水解、淀粉水解、酪素水解阴性；硝酸盐还原、纤维素分解、丙酸盐利用阳性；有荚膜；可发酵葡萄糖、乳糖、核糖醇，不能利用山梨糖和5-酮基-D-葡萄糖酸。
利用16S rRNA基因扩增的通用引物，以75B菌株的总DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经电泳显示扩增到1.5 kb大小目的条带。测序产物经BLAST及EzTaxon-e服务器鉴定，构建系统发育树(图2)，表明75B菌株的16S rRNA基因与Klebsiellavariicola及Klebsiellapneumoniae同源性极高，分子鉴定为Klebsiellasp.。
结合生理生化测定及分子生物学方法，最终将苄嘧磺隆降解菌75B鉴定为Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)。
图1苄嘧磺隆降解菌75B的菌落和镜下Gram染色图谱
2.2苄嘧磺隆降解菌株75B在不同环境条件下的生长
2.2.1降解菌株75B在不同培养基中的生长曲线当把降解菌株75B接种入LB、含50 mg/L苄嘧磺隆的LB培养基中，结果显示出相似的生长趋势；另外，在LB培养基中加入50 mg/L苄嘧磺隆后，降解菌株75B的生长稍稍有所滞后，表明苄嘧磺隆的加入对于苄嘧磺隆降解菌株仍然存在略微的影响，这主要表现在对数生长期的生长速率有所降低。但是，当培养至稳定期后期(24 h)，在两种培养基中的菌体生长量(OD600值)并未有显著差别(p0.05)(图3)，降解菌株可以快速适应苄嘧磺隆的存在。
图2苄嘧磺隆降解菌75B的16S rRNA基因系统发育树
图3苄嘧磺隆降解菌株75B的生长曲线
2.2.2培养基不同pH值及NaCl浓度对降解菌株生长的影响在不同pH值的LB培养基(含50 mg/L苄嘧磺隆)中，降解菌株75B的菌体生长量在对数生长期存在差异，pH 7.0的培养基中生长速率最快(p0.05)，最适pH值为7.0。进入稳定期后期，pH值对菌体生长量的影响下降，该菌株在pH 5.09.0范围内生长良好，表明75B对环境pH值有较强的适应能力(图4)。
2.2.3不同接种量及装液量对降解菌株生长的影响设置4个不同接种量接种菌液，结果表明，在接种量为1%时，75B菌株的菌体生长量低于其余3个处理，而当接种量为5.0～10.0%范围内时，菌体OD600值并无显著差异(p<0.05)。因而，适当加大接种量可使菌体缩短适应期而进入快速生长阶段，但接种量与菌体生长量之间并不呈完全对应增长趋势，降解菌株75B的最适接种量为5.0%。而在3个不同的装液体积下，菌体生长量并无明显差异(图5)。
注：上图为不同pH值，下图为不同NaCl浓度，*代表差异显著(p<0.05)
图4培养基不同pH值及NaCl浓度对苄嘧磺隆降解菌株75B生长的影响
2.2.4不同培养温度对降解菌株生长的影响温度通常对微生物的生长影响较大。在4个不同的温度条件下培养75B菌株，34℃条件下的菌体生长量略高；除在培养初期(12 h)，测试的最低温度(26℃)及最高温度(38℃)下菌体OD600值略低于其余处理外；总体上，在26～38℃温度范围内，苄嘧磺隆降解菌株75B的生长良好，菌株可以耐受较广的温度范围。
注：上图为不同接种量，下图为不同装液量，*代表差异显著(p<0.05)
图5接种量及装液量对苄嘧磺隆降解菌株75B生长的影响
图6不同培养温度对苄嘧磺隆降解菌75B生长的影响
2.3苄嘧磺隆降解菌株75B的生长及降解
将活化的75B菌株培养液以5%接种量、转接入以苄嘧磺隆为唯一碳源的无机盐培养基(pH 7.0，含2.0%NaCl)中，34℃摇床振荡培养监测菌体生长量。结果表明，菌体在150 mg/L苄嘧磺隆的培养基中基本无生长；而50 mg/L和100 mg/L浓度下菌体的延滞期达3 d左右，之后OD600值开始逐渐呈上升趋势。在含50 mg/L苄嘧磺隆的MSM培养基中，75B菌株的生长明显优于另两组处理(p0.05)(图7)。收集该浓度下的菌体培养液，经萃取、蒸干后进行HPLC测定，显示75B菌株对50 mg/L苄嘧磺隆的5 d降解率为74.11%，培养至10 d时的降解率高达97.65%(图8)。
注：*代表差异显著(p<0.05)
图7降解菌株75B在以不同浓度苄嘧磺隆为唯一碳源MSM培养基中的生长
图8苄嘧磺隆降解菌株75B对50 mg/L苄嘧磺隆的降解能力
3结论
苄嘧磺隆是20世纪80年代中期开发的一种新型磺酰脲类除草剂，是我国水稻田中使用面积广、时间长、用量大的除草剂之一。由于其在土壤中的持效期较长，大量施用后会对环境造成一定危害。本研究采集长期施用野老除草剂(含苄嘧磺隆6%)的稻田土壤，经富集、驯化后分离到1株苄嘧磺隆降解菌株75B，形态学、生理生化研究及分子生物学研究结果显示该菌株为Klebsiellapneumoniae(肺炎克雷伯氏菌)，该菌株对环境的适应能力较强，生长在pH 7.0、含50 mg/L苄嘧磺隆的无机盐培养基(2.0%NaCl)中，34℃条件下培养10 d，对苄嘧磺隆的降解率可达97.65%。
Zhu等在2005年首次报道可降解苄嘧磺隆的短杆菌属(Brevibacteriumsp.)BH菌株，在2535℃条件下、pH7.07.5时，培养7 d对100 mg/L BSM的降解率为29.4%。张松柏等从农药厂工业废水和污泥中富集分离到光合细菌PSB07-6，鉴定为Rhodopseudomonaspalustris(沼泽红假单胞菌)，在pH6.5的光合细菌培养基中30℃条件下培养5 d后，对350 mg/L苄嘧磺隆的降解率为25.03%。Lin等分离到BacillusmegateriumL1菌株，培养84 h对50 mg/L BSM的降解率为12.8%。Xiong等筛选到的Rhodococcussp.BX2菌株对20 mg/L BSM的7d降解率为92%。除此外，彭星星等分离筛选到的苄嘧磺隆降解真菌Aspergillussp.BP-H-01菌株，最适pH 7.5、28℃条件下对25 mg/L BSM的2 d降解率为84.5%。Peng等分离到Penicilliumpinophilum(嗜松青霉)BP-H-02菌株，在30℃条件下置于pH 6.5的培养基中，对50 mg/L BSM的60 h降解率为87%。以上报道的苄嘧磺隆降解菌株最适pH值均为中性或酸性条件。Sabadie等的研究表明BSM在土壤中主要经化学水解和生物学降解进行，其化学水解是pH依赖性的、在酸性或中性条件下(pH8.0)可通过脲桥断裂水解形成稳定的嘧啶胺和苯甲磺酰氨。本研究获得的Klebsiellapneumoniae75B菌株在碱性条件下(pH 7.09.0)生长良好，更有利于碱性土壤中生物降解的进行。另外，该菌株的温度适应范围(2638℃)更广、对50 mg/L苄嘧磺隆的5 d降解率可达74.11%，培养至10 d时几乎可完全降解，是一株降解效果优良的菌株，对于该菌株的进一步研究可为其用于污染土壤的生物修复奠定基础。
Klebsiella属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，在环境中广泛存在，其分离株或具有内生性固氮作用、或者是条件性致病菌。Klebsiellapneumoniae是可定殖和感染多种动植物的克雷伯氏菌属成员。早期的研究表明该菌为条件性致病菌，可致人肺炎及奶牛乳腺炎。近年来发现Klebsiellapneumoniae分离株具有代谢多样性，占据了不同类型的环境生态位；菌种的不同分离株也表现出遗传和表型的多样性。多位研究者发现在玉米或水稻中有该种微生物内生定殖并具有固氮活性，而且玉米分离株较临床分离株的毒力更低。Klebsiellapneumoniae不同地区分离株还被报道具有降解石油、降解苯并芘和芘，可利用单宁酸等多种能力。本研究中分离到的Klebsiellapneumoniae菌株被首次发现还具有降解苄嘧磺隆的能力，也充分表明了该种微生物具有一定的环境生物修复潜能。