烟草黑胫病菌对氟吗啉与甲霜灵的药敏性分析（一）
烟草黑胫病(Tobacco black shank)是一种土传病害，其病原菌为疫霉菌烟草变种(Phytophthora parasitica var.nicotianae)。20世纪80年代后期，由于我国烟草种植面积不断扩大，从而使烟草黑胫病迅速扩展。化学防治是烟草黑胫病防控的重要措施，其中甲霜灵、烯酰吗啉、氟吗啉、霜霉威、恶霉灵等杀菌剂在生产中使用较为广泛。甲霜灵是苯酰胺类内吸性杀菌剂，其作用机制为抑制病原菌的RNA聚合酶活性。目前不同的病原卵菌对甲霜灵均具有抗性，羧酸酰胺类杀菌剂作为苯酰胺类杀菌剂的替代药剂，对病原卵菌具有高效的抑菌活性。氟吗啉是一种肉桂酰胺类杀菌剂，对由霜霉属、假霜霉属、疫霉属等引起的卵菌病害具有优异的保护和治疗效果，但关于烟草黑胫病菌对氟吗啉的敏感性、抗药性研究尚未见报道。
化学药剂复配可以减少农药的使用量，延缓抗药性的发生，降低生产成本，是抗性治理的重要措施之一。生防菌株是天然存在的生物活体，具有良好的环境相容性。“生物-化学”协同防治可减轻化学药剂对环境的压力，具有广阔的应用前景。研究表明，将枯草芽孢杆菌或井冈霉素与杀菌剂复配可防治多种作物病害。奚家勤等从烟草品种K326叶片中分离了一株内生细菌ZY-9-13，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，对包括烟草黑胫病在内的多种病原菌均具有抑制作用，能抑制病原菌菌丝的生长和孢子的萌发。将该菌株与烟草育苗基质混合使用或在烟草植株移栽时施入根际周围，对烟草黑胫病的防治效果显著。目前，防治烟草黑胫病的化学药剂有限，将生防菌剂与化学药剂协同配合防治烟草黑胫病的研究鲜见报道。为此，以从河南省分离的烟草黑胫病菌为试验材料，测定氟吗啉对烟草黑胫病菌的毒力，将氟吗啉与甲霜灵进行二元复配，再以最佳比例的化学药剂与解淀粉芽孢杆菌进行复配，评价其生物-化学协同作用的效果，旨在为降低杀菌剂的抗性风险、研制新型农药奠定基础。
1材料与方法
1.1烟草黑胫病菌的分离培养
2014—2015年从河南省三门峡市(渑池、陕县、灵宝、卢氏)、南阳市(淅川、内乡)、平顶山市(郏县)、周口市(鹿邑)、洛阳市(伊川、洛宁、汝阳)共11个采样点采集患黑胫病的烟株，将病组织表面消毒清洗，放在灭菌的燕麦培养基中25℃培养2~4 d，待长出菌丝后，再次纯化培养烟草黑胫病菌。
1.2供试药剂
氟吗啉标准品(有效成分97%)，甲霜灵标准品(有效成分98%)，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。用二甲基亚砜配置成105μg/mL的母液，置于4℃保存。
1.3药剂敏感性测定
采用菌落生长速率法测定烟草黑胫病菌对甲霜灵和氟吗啉的药剂敏感性。将甲霜灵和氟吗啉的母液分别配置成终浓度为0、0.1、0.3、0.6、1.0、3.0μg/mL和0、0.70、0.85、1.00、2.00、3.00μg/mL的药液，按照1:1 000(体积比)等量加入燕麦培养基中，以只加二甲基亚砜的燕麦培养基为空白对照。用灭菌打孔器制取直径为5 mm的菌饼，将菌饼菌丝面朝下接种于各个浓度的培养皿中央，每个浓度3次重复。25℃恒温培养，待空白对照的菌落直径生长到6~8 cm时，采用十字交叉法测定处理菌落的直径。药剂对病原菌菌丝生长抑制率的计算公式为：
以药剂浓度的对数为x轴，抑制率的机率值为y轴，根据两者间的线性关系，计算出毒力回归曲线方程y=bx+a及其相关系数r，求出药剂对病原菌的有效抑制中浓度EC50。根据烟草黑胫病菌敏感性的分布情况，建立烟草黑胫病菌对氟吗啉的敏感基线。
1.4复配药剂的联合毒力测定
在单剂毒力测定的基础上，按氟吗啉:甲霜灵体积比为1:10、3:20、1:5、3:10、2:5、1:2、3:5、4:5、1:1、2:1、3:1、5:1共12个复配比例测定复配药剂的抑菌率，每个复配比例设置6个浓度梯度，药剂终浓度为0、0.3、0.5、0.7、1.0和3.0μg/mL。采用Wadley方法对复配制剂进行联合作用评价，评价公式为：
式中：a、b分别为氟吗啉与甲霜灵的复配比例，%；EC(A)50为氟吗啉的有效抑制中浓度，μg/mL；EC(B)50为甲霜灵的有效抑制中浓度，μg/mL。
式中：EC50(th)为混剂的理论有效抑制中浓度，μg/mL；EC50(ob)为混剂的实测有效抑制中浓度，μg/mL。
SR≤0.5，表明两种药剂复配具有拮抗作用；SR在0.5~1.5时，表明两种药剂复配具有相加作用；SR≥1.5，表明两种药剂复配具有增效作用。
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