稻花香馫香型根霉曲、中高温大曲和高温大曲的酶活力和微生物数量统计（下）
2.3.2高通量测序分析微生物群落组成
在门水平和属水平上分别计算了各样本的细菌群落的物种平均相对丰度（n=3），如图2所示。（1）高温大曲（GW）在门水平上的优势菌群（平均相对丰度＞1%）包括Firmicutes（厚壁菌门，50.13%），Proreobacteria（变形菌门，33.13%）和Actinobacteria（放线菌门，15.84%）；在属水平上有Bacillus（芽孢杆菌属，32%），Kroppenstedtia（21.6%），Saccharopolyspora（糖多孢菌属，18.06%），Thermoactinomyces（高温放线菌属，9.01%），Norank_f_Pseudonocardiaceae（4.93%），Planifilum（3.4%），Staphylococcus（葡萄球菌属，3.13%）和Pediococcus（片球菌属，1.75%）。（2）中高温大曲（ZGW）在门水平上的优势菌群有Firmicutes（厚壁菌门，50.76%），Proteobacteria（变形菌门，21.21%）和Actinobacteria（放线菌门，14.81%）；在属水平上有Bacillus（芽孢杆菌属，17.96%），Kroppenstedtia（16.23%），Thermoactinomyces（高温放线菌属，8.73%），Weissella（魏斯氏菌属，5.48%），Lactobacillus（乳杆菌属，3.8%），Pediococcus（片球菌属，2.46%），Planifilum（1.96%）和Staphylococcus（葡萄球菌属，1.69%）。（3）根霉曲在目水平未分类。
在门水平和属水平上分别计算了各样本的真菌群落的物种平均相对丰度（n=3），如图3所示。（1）高温曲（GW）在门水平上的优势菌群（平均相对丰度＞1%）为Ascomycota（子囊菌门，99.86%），在属水平上有Thermomyces（嗜热真菌属，79.49%），Thermoascus（嗜热子囊菌属，13.98%），Aspergillus（曲霉菌属，1.91%）。（2）中高温大曲（ZGW）在门水平上的优势菌群有Ascomycota（子囊门，86.27%），Mucoromycota（毛霉门，5.46%）和Basidiomycota（担子菌门，8.19%）；在属水平上有Thermoascus（嗜热子囊菌属，62.72%），Thermomy-ces（嗜热真菌属，4.53%），Cutaneotrichosporon（5.56%），Candida（假丝酵母属，3.53%），Rhizopus（根霉菌属，5.36%），Aspergillus（曲霉菌属，3.04%），Hyphopichia（2.29%），Trichomonascus（2.29%）和Xeromyces（耐干霉菌属，1.89%）。（3）Rhizopus（根霉菌）作为根霉曲中的优势菌种，丰度达99.99%。
2.4物种Venn图
Venn图能够得到不同样品之间相同的物种组成，3种曲的Venn图分析如图4所示。3种曲共有的细菌属有25种，中高温大曲和高温大曲共有的细菌属有185种，中高温大曲和高温大曲分别与根霉曲的物种重合有37和26种。其中，中高温大曲物种最为丰富，达591种，高温大曲210种，而根霉曲只有41种。3种曲共有的真菌属有4种，中高温大曲和高温大曲共有39种。其中物种最多的是中高温大曲96种，而高温大曲和根霉曲分别只有49种和5种。
图4样品属水平细菌（A）和真菌（B）venn图
3讨论
作为白酒酿造过程中起重要作用的液化酶和糖化酶，直接影响着原料中淀粉的转化效率及出酒率。酸性蛋白酶可以分解原料中的大分子蛋白，为微生物生长提供氮源，促进发酵。酯化力是大曲自身经发酵成熟后固有的催化醇和羧酸生成酯的能力，而生成的酯是浓（酱）香型白酒重要的主体香味物质。本研究发现，中高温大曲的糖化力更高；根霉曲的酸性蛋白酶活和酯化力大于高温大曲和中高温大曲。因此3种曲在稻花香馫香型白酒酿造的不同阶段加入，不仅有利于提高出酒率，还有利于馫香型香气的形成。
大曲微生物代谢产生的乙醇和各种风味物质，是白酒的关键组分。本研究首先使用平板计数测定微生物数量，结果表明，中高温大曲的霉菌、酵母菌、芽孢杆菌以及总细菌数量高于高温大曲。微生物计数虽然对微生物进行了绝对定量，并侧面反映了大曲中微生物的生长趋势，但由于仅仅反映的是可培养微生物，且受环境中的温度、湿度和气候等因素影响很大,因此，对大曲微生物的认识存在很大的局限性。本研究针对上述问题，通过高通量测序技术分析了稻花香馫香白酒3种酒曲微生物群落多样性及组成。在测定的3种酒曲中，根霉曲的Shannon指数最小，其中根霉菌的相对丰度达99.99%，而中高温大曲相比高温大曲和根霉曲而言，其细菌和真菌群落的Shannon指数更高，具有更高的物种丰富度和均匀度，并且在属水平上拥有近600种细菌，真菌也有将近100种。这可能是由于高温大曲的品温过高，引起不耐高温微生物在制曲过程中死亡；而根霉曲采用的是纯种制曲，基本以根霉菌为主，也包括极少量来自环境及工具的细菌。
制曲温度影响着大曲微生物群落结构的组成。本研究发现，中高温大曲和高温大曲细菌群落都由Bacillus（芽孢杆菌属）占主导地位，丰度分别为17.96%和32%，侧面印证了传统稀释涂平板法中芽孢杆菌占总细菌的绝大多数的结果。同时还发现中高温大曲的细菌相较于高温大曲而言，Thermoactinomyces（高温放线菌属）和Bacillus（芽孢杆菌属）明显下降。芽孢杆菌产多种蛋白酶，是大曲中风味物质的主要来源。高温放线菌属常见于自然界高温场所，具备耐高温特性，适应大曲发酵中的高温环境，具备开发高温淀粉酶、蛋白酶、酯酶、脱氢酶和多酚氧化酶等潜力。在真菌群落组成中，Thermomyces（嗜热真菌属）在高温大曲的相对丰度远高于中高温大曲（4.53%），达79.49%。而Thermoascus（嗜热子囊菌属）作为中高温大曲中占主导地位的真菌属，相对丰度达62.72%，远高于高温大曲中的丰度（13.98%）。嗜热真菌属产木聚糖酶和蛋白酶等酶类，李欣等发现嗜热真菌属是酒醅发酵过程中产酶的主要功能菌。嗜热子囊菌产纤维素酶和蛋白酶，可降解糖类和蛋白质等并具有良好的热稳定性,有利于大曲产酒生香作用。两种大曲拥有不同的微生物群落组成，可能是由于不同的制曲温度引起的：高温大曲培菌温度在63～68℃之间，中高温大曲培菌温度在55～60℃之间。根霉曲中，根霉菌产糖化酶、液化酶、蛋白酶和脂肪酶，还能产生各种有机酸，可为其他微生物的代谢提供基础物质，对整个糖化发酵过程以及白酒的风味都具有一定影响。
本研究系统性地检测分析了稻花香酒厂用于馫香型白酒酿造的3种曲（中高温大曲、高温大曲和根霉曲）中微生物的群落结构，同时对曲样的酶学指标进行测定，简单分析了酒曲中细菌真菌数量及群落结构的差异和酶活力之间的关系，为优化稻花香酒曲工艺、提高酒曲质量提供了参考依据，具有理论和实践意义。
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