焦化污染场地中萘降解菌株AO-4鉴定、生长、降解机理及环境条件带来的影响（三）
2结果与讨论
2.1萘降解菌的筛选及鉴定
通过增加环境选择的压力，逐步提高萘的浓度对菌种进行驯化、筛选，分离到一株萘的高效降解菌株AO-4。菌株在萘选择性培养基中的生长良好，验证了其以萘作为唯一碳源生长的能力，表明其可用于含萘污染物的生物修复。
AO-4菌株在含萘的MSM固体培养基上菌落呈乳白色，扁平状，边缘不整齐，大小不一，平均直径约为2.0～3.0mm[图1(a)]。显微镜下可见菌体为杆菌，长约1.5～3.0μm，宽约0.5～0.8μm，革兰氏染色后呈红色，为革兰氏阴性细菌[图1(b)]。杆状细菌在污染物的微生物降解中非常常见，因为在富集培养过程中，杆菌比球菌能更好地适应环境，可高效利用一些致密颗粒（如PAHs），比球菌分裂更快而成为优势菌群。
图1菌株AO-4的菌落形态(a)及革兰氏染色后细胞形态(b)
通过16S rDNA测序及Genbank数据库序列比对，发现菌株AO-4与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的同源性最高，序列相似度达到99.9%。采用邻域连接法构建了系统发育树（图2），显示菌株AO-4与多株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）具有高度同源性。已有众多研究证明，铜绿假单胞菌对多种PAHs具有较强的降解能力，如Patowary等发现铜绿假单胞菌在35℃和pH=7条件下，对0.3%的萘降解率可达89.2%。
图2基于菌株AO-4的16S rDNA基因片段序列构建的系统发育树
综上，依据菌株AO-4的形态特征以及分子生物学鉴定结果，将菌株AO-4鉴定为铜绿假单胞菌，此菌株16S rDNA序列已提交到国家微生物科学数据中心（DOI：http://dx.doi.org/10.12210/sequence.NMDCN00011F3）。
2.2萘降解途径关键酶的基因检测
假单胞菌对萘的降解通常是通过水杨酸途径完成的。萘经萘双加氧酶催化开环形成顺-萘双氢二醇后，在脱氢酶的催化下形成1，2-二羟基萘，再经过一系列反应生成水杨醛，随后经水杨醛脱氢酶作用形成水杨酸，水杨酸在水杨酸羟化酶催化下形成邻苯二酚，通过邻苯二酚2，3-双加氧酶开环后被转化为乙醛和丙酮酸进入三羧酸循环，最终被降解为H2O和CO2。
选取了萘经水杨酸代谢途径降解的关键酶基因：萘双加氧酶的铁硫蛋白大亚基（nahAC）、水杨醛脱氢酶（nahF）、水杨酸羟化酶（nahG）和邻苯二酚2，3-双加氧酶（nahH）分析菌株对萘可能的降解途径。以菌株AO-4染色体为模板进行上述四种基因的特异性扩增，凝胶电泳图（图3）上可见nahAC和nahH在750～1000bp位置均出现明显条带，与文献中假单胞菌的nahAC（1009bp）、nahH（923bp）基因大小基本一致，可基本判断AO-4的基因组中含有nahAC、nahH两个基因。在AO-4的基因组中未检测到基因nahF和nahG，一方面这可能是由于该菌株对污染物萘的降解有别于已知的降解途径；另一方面有研究表明，PAHs的部分降解基因位于菌株的质粒上，此处未对菌株的质粒DNA进行扩增，这可能是nahF和nahG这两个基因未被检出的原因。
图3萘降解途径中的部分关键酶基因nahG、nahF、nahAC和nahH的PCR扩增结果
先前研究表明所有的萘降解菌都含有nahAC基因，通过对萘降解途径中的关键酶基因（nahAC、nahH、nahF和nahG等）进行检测，可以初步筛选萘降解菌株、判断菌株的萘降解途径，但对降解途径的进一步探究还需对中间产物进行检测。
2.3菌株AO-4对萘的降解性能
研究考察了菌株AO-4在液体中对萘的降解能力，萘浓度为菌株驯化的最高浓度400mg/L，体系的pH为7.0，接种菌量为2%（体积分数）。在降解过程中监测了菌株AO-4的生长曲线、萘的降解率和菌体脱氢酶活性随时间的变化，结果如图4所示。
图4菌株AO-4对萘的降解特性
从菌株生长曲线[图4(a)]可以发现，菌体浓度随时间变化逐渐增大，在24h OD600达到0.325后增长速度减缓，菌株生长经历了适应期、对数期后将进入稳定期。菌株AO-4在以萘为唯一碳源的无机盐培养液的生长再次验证了菌株AO-4代谢萘的能力。
菌株AO-4对萘的降解率[图4(b)]在反应开始的8h内略有增长，在8～24h之间400mg/L的萘近乎被完全降解，24h时萘的降解率达到97.67%，48h降解完全。这与菌株生长曲线变化趋势相近，8～24h期间，菌株迅速生长，降解率快速攀升；24h后菌株处于稳定期，代谢过程缓慢。在研究玫瑰色红球菌对芘降解特性时，也有类似现象，菌株在8d降解率达到47%后，8～16d时菌株处于稳定期或衰亡期，降解率无明显变化。
脱氢酶活性[图4(c)]在前8h升高比较缓慢，8～24h迅速升高，在24h后仍有缓慢增长的趋势。PAHs的降解是基于PAHs的氧化，降解过程中脱氢酶可以使PAHs的氢原子活化并转移至特定的受氢体，使PAHs被氧化。脱氢酶活性可在一定程度上反应微生物对有机污染物的氧化降解能力。以上结果表明菌株AO-4可有效利用400mg/L萘作为碳源生长，菌体的脱氢酶活性，菌株生长情况与萘的降解率表现出正相关。
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