罗尔阿太菌生长曲线、原生质体制备条件及融合技术（三）
2结果与分析
2.1罗尔阿太菌生长曲线
通过测定菌体生长曲线得知30——80 h菌体生长旺盛，为罗尔阿太菌生长对数生长期，此时制备原生质体，可得到较高的原生质体形成率和再生率。因此选用培养55 h的菌体用于原生质体制备。
2.2原生质体制备条件
2.2.1制备条件对原生质体形成率和再生率的影响
由图1a可知在添加单一种类酶中，第3组溶壁酶的去壁和再生效果最好，原生质体的形成率为71.343%，再生率为9.003%.而第1组纤维素酶和第2组蜗牛酶的形成率和再生率都偏低。第4、5、6和7组复合酶的形成率和再生率都高于单一酶，尤其是第5组复合酶原生质体的形成率为92.765%，再生率为18.869%，效果最好。
由图1b可知随着复合酶浓度的增加，原生质体的形成率逐渐增加，再生率逐渐降低。原因可能是随着复合酶浓度的增加，细胞壁与酶分子接触机会增加，细胞壁被酶解的几率增大，因此形成率增大。但当复合酶浓度过高时，不仅细胞壁被酶解，细胞膜也遭到严重破坏，致使原生质体再生困难，造成再生率下降。当复合酶为3.1 mg·mL——1时，原生质体的形成率为93.133%，再生率为18.932%，综合效果较好。
由图1c可知当温度为30℃时，原生质体的形成率最高，为92.767%.当温度为32℃时，原生质体再生率最高。这是由于酶在其最适温度下才能发挥最高活力，温度低，只能酶解部分细胞壁，原生质体形成率和再生率都不高。温度高不利于原生质体的形成，导致形成率和再生率下降。考虑到原生质体再生是原生质体灭活的关键，温度采用32℃。
由图1d可知随着酶解时间的延长，原生质体形成率逐渐提高，而再生率逐渐下降。原因可能是酶解时间越长细胞壁被水解的越完全，使原生质体形成率提高，但酶解时间过长时，酶在酶解细胞壁的同时也会损伤细胞膜，使原生质体再生困难，导致原生质体再生率下降，当酶解时间为55 min时，原生质体形成率为92.134%，再生率为17.332%，综合效果较好。
由图1e可知，pH 5.5时原生质体的形成率和再生率均达最大值。这可能是由于pH 5.5处于蜗牛酶（5.0——5.8）、纤维素酶（4.0——5.5）、溶壁酶（5.4——6.0）的适宜范围内，酶解效果好，因此原生质体形成率和再生率最高。
图1制备条件对原生质体形成率和再生率的影响
由图1f可知KCl作为渗透压稳定剂破壁效果均优于MgSO4、NaCl和蔗糖，原生质体形成率和再生率分别为93.501%和18.867%.利用spss16.0软件进行单因素方差分析，结果表明Sig为0.000，差异极显著，按照显著性水平P＜0.05分成3列（KCl、NaCl和蔗糖、MgSO4），三者之间有着显著差异，其中NaCl和蔗糖之间差异不显著。这可能是由于KCl作为渗透压稳定剂更易避免原生质体膨胀破裂。因此采用KCl作为渗透压稳定剂进行原生质体制备。
2.2.2原生质体制备最佳条件的选择
原生质体制备正交试验结果见表2.由表2可以看出，极差R的分布大小依次为复合酶浓度（A）＞酶解时间（C）＞酶解温度（B）＞渗透压稳定剂（E）＞pH（D）。这表明复合酶浓度对原生质体形成率和再生率影响最大，pH影响最小。原生质体制备最佳组合条件为A2B2C3D2E3，即0.4 mol·L——1的KCl作为渗透压稳定剂，复合酶3.1 mg·mL——1，pH 5.5、32℃条件下酶解55 min，原生质体形成率为93.534%，再生率为18.921%.
表2原生质体制备正交试验结果
2.3紫外灭活和热灭活对原生质体致死率的影响
紫外灭活和热灭活对原生质体致死率的影响如图2所示，由图2a可以看出随着紫外照射时间的延长，原生质体致死率升高。紫外照射5 min，原生质体致死率达98.6%，照射6 min，原生质体致死率达100%，因此6 min为紫外灭活最佳时间。
图2紫外灭活和热灭活对原生质体致死率的影响
由图2b可以看出，45℃热处理60 min，55℃热处理55 min，65℃热处理40 min，原生质体致死率均达100%.为了在最短时间内达到灭活目的，选择65℃热处理40 min。
相关新闻推荐
1、RW、WK、SF发酵菌株不同组合对紫秋葡萄酒品质、香气的影响（三）