枯草芽孢杆菌BC80-6发酵培养基、生长条件及对烟草根黑腐病菌生防作用（二）
2、结果与分析
2.1、处理液对烟草根黑腐病菌菌丝生长及孢子萌发的影响
由表1可知，3种枯草芽孢杆菌BC80-6处理液对烟草根黑腐病菌菌丝的生长均具有抑制作用。随着处理液稀释倍数的增加，其对BC80-6菌丝生长的抑制率逐渐减小。其中，活菌液的抑制效果最好，10-1倍的活菌液对BC80-6菌丝生长的抑制率为93.20%。10-1倍的过滤液和高温灭菌液对BC80-6菌丝生长的抑制率分别为74.9%、7.4%，高温灭菌液抑制效果最差。
表1不同处理液对烟草根黑腐病菌的抑制作用
3种枯草芽孢杆菌BC80-6处理液对烟草根黑腐病菌孢子的萌发均具有抑制作用（表1）。其中，活菌液和过滤液对烟草根黑腐病菌孢子的萌发均具有较好的抑制作用，10-1倍的活菌液和过滤液对孢子萌发的抑制率分别为95.3%、93.4%。随稀释倍数的增加，活菌液和过滤液对孢子萌发的抑制率逐渐降低，且不同稀释倍数之间差异显著。灭菌液的抑制效果最差，10-1、10-2、5×10-2倍的灭菌液对孢子萌发的抑制率为30.3%、3.8%和2.4%。
2.2、培养基成分的优化
2.2.1碳源的优化
由图1可知，菌株BC80-6在不同碳源培养基中均可生长。其中，在蔗糖为碳源的培养基中，菌株BC80-6的活菌含量最高，为1.58×109 cfu·mL-1；葡萄糖和乳糖次之，其活菌含量分别为1.42×109和1.39×109 cfu·mL-1。因此，菌株BC80-6生长的最佳碳源是蔗糖，其次是葡萄糖。
图1碳源对枯草芽孢杆菌生长的影响
2.2.2氮源的优化
由图2可知，氮源为有机氮时菌株BC80-6的生长明显优于无机氮。以无机氮（尿素、氯化铵）为氮源，菌株BC80-6的活菌含量较少（<0.28×109 cfu·mL-1），说明菌株BC80-6不能很好地利用这两种氮源。以有机氮（酵母浸出物、牛肉膏、蛋白胨和大豆蛋白胨）为氮源，菌株BC80-6的活菌含量均高于1.2×109 cfu·mL-1。菌株BC80-6生长的最适氮源是酵母浸出物，活菌含量为1.95×109 cfu·mL-1。
图2氮源对枯草芽孢杆菌生长的影响
2.2.3无机盐的优化
由图3可知，菌株BC80-6在无机盐为MgSO4、CaCl2、NaCl2的培养基中生长较好，活菌含量较多，分别为1.98×109、1.54×109和1.52×109 cfu·mL-1。菌株BC80-6不适合在含FeSO4的培养基中生长，活菌含量仅为0.62×109 cfu·mL-1，远小于CK（1.4×109 cfu·mL-1）的活菌含量。因此，菌株BC80-6在无机盐为MgSO4的培养基中生长最好。
图3无机盐对枯草芽孢杆菌生长的影响
2.3、碳源、氮源、无机盐3因素的正交优化
由2.2节结果可知，最佳碳源、氮源、无机盐的种类分别是：蔗糖、酵母浸出物、MgSO4。蔗糖、酵母浸出物、MgSO4各设3个含量水平，进行正交试验（表2）。
表2正交试验因素和水平编码
正交试验结果（表3）表明：当培养基中的酵母浸出物、蔗糖、MgSO4含量分别为0.5%、1.5%、0.06%时，菌株BC80-6的活菌含量最高，即最适合菌株BC80-6的生长。R值能反应3种因子对活菌含量影响的大小，R值越大，则该因子的影响越大。RA>RB>RC，即酵母浸出物含量对菌株BC80-6生长的影响最大，为主要因子，蔗糖含量其次，MgSO4影响最小。
表3 L9（33）正交试验结果①
注：①K1、K2、K3分别代表各因素1、2、3水平的3次活菌含量之和；k1、k2、k3分别代表对应K的平均值；R代表极差值，即各因素各水平下k值对应的最大值与最小值之差。
F检验结果（表4）表明：酵母浸出物的F值最大，为110.789（>F0.01），呈极显著差异，是主要影响因素。蔗糖的F值介于F0.01与F0.05之间，呈显著差异。硫酸镁的F值<F0.05，对菌株BC80-6生长的影响较小。
表4正交试验的方差分析
2.4、发酵条件的优化
2.4.1生长曲线的测定
由图4可知，0~3 h为菌株BC80-6的生长停滞期，活菌含量增长较少。3 h后菌株BC80-6生长较快，活菌含量大幅增加。9~24 h，菌株BC80-6生长稳定，活菌含量增长缓慢。24 h活菌含量达到最大，为2.5×109 cfu/mL。24 h后活菌含量开始减少，菌株BC80-6进入生长衰亡期。因此，选用培养9~24 h的菌液为菌种较合适，此时菌株BC80-6在对数生长末期，既有较高的细胞活力，又可获得较多的细胞数。
图4枯草芽孢杆菌BC80-6的生长曲线
2.4.2培养温度的优化
由图5可知，菌株BC80-6适宜在25~28℃生长。在28℃时，其发酵液里活菌含量最多，为2.52×109 cfu/mL。因此，28℃是菌株BC80-6的最适培养温度。
图5温度对枯草芽孢杆菌BC80-6生长的影响
2.4.3培养液初始pH的优化
由图6可知，当pH在5.5~6.5之间，菌株BC80-6的活菌含量随pH的增大而增大。当pH为6.5时，活菌含量达到最大，为2.44×109 cfu/mL。当pH在6.5~8.0之间，随着pH的增大，菌株BC80-6的活菌含量明显下降。因此，培养液的pH应控制在6.5左右。
图6 pH对枯草芽孢杆菌BC80-6生长的影响
2.4.4接种量的优化
当接种量为5%时，菌株BC80-6的活菌含量最多，为2.48×109 cfu/mL。因此，5%的接种量为最适接种量。
2.4.5转速的优化
转速从120 r/min增加至180 r/min时，菌株BC80-6的活菌含量逐渐增加，转速从180 r/min增加至220 r/min时，活菌含量逐渐减少。转速为180 r/min时，菌株BC80-6的活菌含量最多，为2.48×109 cfu/mL，表明转速影响菌株BC80-6的生长。因此，菌株BC80-6的最佳转速为180 r/min。
2.4.6装液量的优化
装液量不同，菌株BC80-6的活性不同。当250 mL三角瓶的装液量在20~40 mL之间时，菌株BC80-6的活菌含量随装液量的增加而增加。当250 mL三角瓶的装液量大于40 mL时，活菌含量随装液量的增加而下降。装液量为40 mL时，菌株BC80-6的活菌含量最多，为2.46×109 cfu/mL。因此，摇床培养时，250 mL三角瓶的最佳装液量为40 mL。
2.5枯草芽孢杆菌BC80-6对烟草根黑腐病的田间防控效果
大多数对照组烟苗出现明显的根黑腐病症状，烟苗根系出现黑色腐烂，植株明显矮化，叶片萎蔫，长势较差。菌株BC80-6处理的烟苗地上部分较少出现萎蔫症状，长势较好，根部正常。由表5可知，菌株BC80-6处理的烟株发病率和病情指数显著低于对照组，大田防治效果达88.19%。与生产上使用的化学药剂（多菌灵和甲基托布津）防治效果差异不大。
3、讨论
枯草芽孢杆菌可通过产生抗菌物质来抑制病原菌的生长。本研究中，枯草芽孢杆菌BC80-6的过滤液和灭菌液对烟草根黑腐病菌的菌丝和孢子有一定抑制作用，表明菌株BC80-6可产生某些抗菌物质来抑制烟草根黑腐病菌的生长。菌株BC80-6活菌液对烟草根黑腐病菌菌丝和孢子的抑制效果最好，可能是由于菌株BC80-6不断繁殖产生更多抗菌物质，或与病原菌不断争夺营养，从而有效地抑制病原真菌生长。
通过发酵试验对菌株BC80-6培养基的配方及培养条件进行优化，结果表明培养条件的不同，碳氮无机盐及其含量的不同对菌株BC80-6的活菌含量影响很大。优化后的菌株BC80-6培养基成分及其含量与已报道的培养基成分具有差异，可能跟不同菌株的生活环境不同、所需要的营养成分也不同有关。不同细菌的寄居环境不同，因而其最佳发酵条件也不同。优化后的培养基成分较少、价格相对较低，而且是生产上较容易获得的化工原料，因而在工业化发酵生产中有一定的优势。
在温室中测定了芽孢杆菌对烟草根黑腐病菌的控病试验，发现芽孢杆菌的防效为80.2%，与对照药剂多菌灵和甲基托布津的处理效果无明显差异。本试验中，菌株BC80-6对烟草根黑腐病的大田防效为88.19%，接近生产上使用的多菌灵和甲基托布津（分别为92.21%、89.66%）的防效。表明芽孢杆菌具有较好的生物防治能力，可用于烟草根黑腐病的生物防治。
4、结论
①在3种枯草芽孢杆菌BC80-6处理液对烟草根黑腐病菌菌丝生长、孢子萌发的抑制试验中，抑制效果最好的是10-1倍活菌液。②1.5%蔗糖、0.5%酵母浸出物、0.06%硫酸镁（质量体积比）是培养菌株BC80-6的最佳培养基配方。③在时间24 h、温度28℃、初始pH 6.5、摇床转速180 r/min、接种量5%、250 mL三角瓶装液量40 mL的条件下，最有利于菌株BC80-6的发酵。④菌株BC80-6活菌液对烟草根黑腐病的大田防效达88.19%。
枯草芽孢杆菌BC80-6发酵培养基、生长条件及对烟草根黑腐病菌生防作用（一）
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