无性型虫草菌株qsun-1发酵培养基组成成分优化及生长影响因素
虫草菌[Cordycepssinensis(Berkey)Sacc.]隶属于真菌界(Fungi)、子囊菌门(Ascomycota)、子囊菌纲(Ascomycetes)、粪壳菌亚纲(Sordariomycetidae)、肉座菌目(Hypocreales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordyceps)[1-3]。一般虫草菌侵染寄主后，菌丝体分化形成垫状结构即子座。子座膨大并产生子实体，即子囊壳，成熟的子囊壳中产生子囊和子囊孢子。在野外虫草菌孢子在夏季萌发侵染土壤中的蝙蝠蛾幼虫后，形成的子座在次年5月份长出地面[4]，貌似草，这种蝙蝠蛾幼虫与虫草菌的复合体称为冬虫夏草。冬虫夏草主要分布于我国的青藏高原海拔3 500～5 000 m的高山草甸或高山灌丛草甸，在四川、云南和甘肃也有少量分布[5]。作者从野外采集的冬虫夏草中分离无性型虫草菌株，对菌虫体组织和子座组织萌发、无性型虫草菌株菌落形态及显微结构进行了观察，同时对无性型虫草菌株发酵培养基组成成分进行了优化，以期为人工培育冬虫夏草以及无性型虫草菌株发酵提供理论基础。
1实验材料
1.1冬虫夏草
新鲜冬虫夏草，采自四川省阿坝藏族羌族自治州黑水县，冰箱中4℃保存。
1.2培养基
分离培养基(PDA培养基):马铃薯20%，葡萄糖2%，VB10.01%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，琼脂2%，pH 6.0。用于无性型虫草菌株的分离。
斜面培养基(1%牛肉粉PDA培养基):马铃薯20%，葡萄糖2%，牛肉粉1%，VB10.01%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，琼脂2%，pH 6.0。用于无性型虫草菌株的保藏。
基础培养基:葡萄糖3%，牛肉粉2%，KH2PO40.1%，MgSO40.1%，VB10.01%，pH 6.0。用于无性型虫草菌株的发酵。
2实验方法
2.1分离
用水清洗冬虫夏草表面的杂质，在无菌条件下分别用0.1%氯化汞、75%酒精对冬虫夏草进行表面消毒，无菌水冲洗多次[6]，以头部为界将其剪开，生长子座的头部称为子座组织，头部以外的称为菌虫体组织。将子座及菌虫体组织分别放入分离培养基中，在18℃培养，观察，重复3次，统计萌发情况，并且挑取萌发的菌丝体进一步分离纯化后接入斜面培养基保藏。
2.2生长观察
将分离的无性型虫草菌株qsun-1分别接入PDA及1%牛肉粉PDA平板中，18℃培养，观察生长情况。同时将接有无性型虫草菌株qsun-1的PDA培养基放在15、18、25、32℃培养，观察生长情况。以菌落直径作为衡量生长情况的指标，每隔5 d测量1次。
2.3显微结构观察
无菌操作，用接种棒从液体培养基中挑取菌丝，放在滴有纯化水的载玻片上，轻轻将菌丝展开，不染色直接用显微镜进行观察[7]。
2.4发酵培养基的优化
将无性型虫草菌株qsun-1在1%牛肉粉PDA液体培养基中活化3 d，以5%的接种量接入发酵培养基。发酵条件:装液量每250 mL装100 mL，温度18℃，摇床转速120 r/min，时间5 d。发酵结束后3 000 r/min离心10 min分离菌丝体，烘干称重。
以葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉及甘露醇为碳源，确定最佳碳源。确定蔗糖为最佳碳源后，分别考察1%、2%、3%、4%、5%蔗糖对无性型虫草菌株qsun-1菌体生长的影响，确定最佳蔗糖质量分数。以牛肉粉、蛋白胨、NaNO3、(NH4)2SO4及尿素为氮源，确定最佳氮源。确定蛋白胨为最佳氮源后，分别考察0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%蛋白胨对无性型虫草菌株qsun-1菌体生长的影响，确定最佳蛋白胨质量分数。上述条件确定后依次考察0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%MgSO4和KH2PO4对无性型虫草菌株qsun-1菌体生长的影响，确定最佳的MgSO4、KH2PO4的质量分数[8-10]。
3结果与分析
3.1萌发和分离
对新鲜冬虫夏草不同部位进行分离，得到无性型虫草菌株qsun-1。冬虫夏草子座组织的菌体萌发率为60%，而菌虫体组织的菌体萌发率仅达到14%，可见子座组织菌丝体容易萌发，而菌虫体组织可能由于易受杂菌污染而使萌发受阻。因此，作者从冬虫夏草子座中培养并分离了无性型虫草菌株。
3.2生长特点
3.2.1菌落形态
无性型虫草菌株qsun-1在PDA和1%牛肉粉PDA平板中生长10 d后菌落形态有所不同(图1)。在PDA培养基中菌落稍微隆起，中心凹陷并有少量水珠，灰白色，菌丝较短，菌落周围有一透明圈[图1(a)]，菌落背面暗黄色[图1(b)]，菌落直径21 mm。在1%牛肉粉PDA培养基中菌落明显隆起，纯白色，菌丝粗壮[图1(c)]，菌落背面淡黄色[图1(d)]，菌落直径30 mm。
图1菌株qsun-1菌落形态
3.2.2菌落生长情况
无性型虫草菌株属于嗜低温菌株，对温度变化反应显著。在不同温度下培养的无性型菌株qsun-1生长状况也不同。无性型虫草菌株qsun-1在15～18℃生长良好，在25℃生长受到抑制，在32℃条件下未发现菌株生长。
3.3显微结构
对无性型虫草菌株qsun-1液体培养物进行显微观察，从显微结构可以看到液体培养的菌丝主要为管状菌丝，菌丝有较明显的分隔，粗细均匀，每节菌丝均透明。
3.4发酵培养基的优化
3.4.1碳源对qsun-1生长的影响
无性型虫草菌株qsun-1可以利用多种碳源。当蔗糖为碳源时生长最好，菌体产量达到8.0 g/L，其次是果糖、甘露醇、淀粉和葡萄糖。
3.4.2蔗糖质量分数对qsun-1生长的影响
无性型虫草菌株qsun-1在蔗糖为1%时生长较慢；在蔗糖质量分数达到2%时，生长量最大；当蔗糖质量分数超过2%时，菌体生长受到一定程度的抑制；当蔗糖质量分数达到5%时，菌体生长明显受阻(图2)。
图2蔗糖质量分数对菌株qsun-1生长的影响
3.4.3氮源对qsun-1生长的影响
无性型虫草菌株qsun-1可利用多种氮源。当以蛋白胨为氮源时生长最好，菌体产量达到8.1 g/L，其次为NaNO3、牛肉粉、(NH4)2SO4。以尿素为氮源时，未见无性型虫草菌株qsun-1生长。
3.4.4蛋白胨质量分数对qsun-1生长的影响
无性型虫草菌株qsun-1在蛋白胨为0.5%时，生长缓慢;随着蛋白胨质量分数的增加生长量逐渐增加，在蛋白胨质量分数达到2%时，菌体生长达到最大值;蛋白胨质量分数超过2%后，菌体生长受到抑制。
3.4.5 MgSO4质量分数对qsun-1生长的影响
无性型虫草菌株qsun-1在MgSO4为0.05%时生长较慢，在MgSO4达到0.1%时生长量达最大;MgSO4超过0.1%后生长受到一定程度的抑制，并随着MgSO4浓度的增加而抑制程度增加。
3.4.6 KH2PO4质量分数对qsun-1生长的影响
无性型虫草菌株qsun-1在KH2PO4为0.05%时生长较慢，随着KH2PO4浓度的增加生长量逐渐增加，在0.2%左右时达到最大值，在超过0.2%后菌体生长受到抑制。
4结论
冬虫夏草子座组织菌丝体容易萌发，而菌虫体组织中可能由于易受杂菌污染菌丝体萌发受阻。作者从冬虫夏草子座中培养并分离出无性型虫草菌株qsun-1。通过在PDA和1%牛肉粉PDA中培养无性型虫草菌株qsun-1，发现1%牛肉粉PDA更适于qsun-1生长，qsun-1在1%牛肉粉PDA培养10 d，菌落明显隆起，纯白色，菌丝粗壮，菌落背面淡黄色，菌落直径30 mm。观察qsun-1的显微结构，可以看到液体培养的菌丝主要为管状菌丝，菌丝有较明显的分隔，粗细均匀，每节菌丝均透明。通过在不同温度下培养菌株qsun-1，发现其生长温度范围在15～18℃。无性型虫草菌株qsun-1最佳发酵培养基组成为:蔗糖2%，蛋白胨2%，MgSO40.1%，KH2PO40.2%。