不同碳源、氮源和金属离子对耐锌菌株的生长特性的影响（一）
从造纸厂排污口的土壤中分离对锌具有较强耐受性的菌株HXZ-1。菌株HXZ-1能够在含锌离子浓度为50 mg/L的液体培养基中生长良好，能耐受锌离子的最高浓度为1000 mg/L。结合其生理生化特征和16S rRNA基因系统发育分析，将该菌株鉴定为原小单孢菌属(Promicromonosporasp.HXZ-1)。菌株HXZ-1最适培养条件为：锌离子浓度为50 mg/L、葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源。当锌离子浓度为50 mg/L时，菌株HXZ-1对锌吸附率最大，为29.1%；当锌离子浓度为500 mg/L时，培养时间为10 h时，菌株HXZ-1吸附率最大，为18.8%。菌株HXZ-1是一株对锌有较强抗性和吸附性的细菌，为重金属污染的微生物修复提供参考。
随着现代工业的发展，资源开发与利用为国家的建设和发展做出了巨大贡献的同时，也造成了生态环境的破坏甚至生态失衡，比如采矿、冶金、炼油等重工业产生的污染物。越来越多的重金属离子通过各种途径进入土壤和水体环境中，从而对生态环境和人体健康造成了重大影响[1]。
锌是维持机体正常生长发育、新陈代谢的重要物质，曾被誉为“生命之花”[2]。锌离子进入环境后，它具有高毒性、难转化、难迁移和生物富集等特性。其一旦进入环境后不能被生物转化，将参与食物链的循环，最终在人体内富集，破坏人体内正常的生理代谢，危害人体健康[3]。实验和流行病学调查证实，人体尿样中含锌量为1000μg/L以上时，人体处于锌中毒状态[4]。
微生物修复技术因其具有处理费用低,对环境影响小、效率高等优点,在治理重金属污染方面具有广泛的应用前景。近年来，利用环境中的微生物来修复重金属离子对生态环境的污染问题逐渐引起人们的重视。如廖佳等从铅锌矿区分离筛选出耐锌菌株AspergillusoryzaeHA，研究了不同试验条件对菌株生长的影响以及菌株对锌离子的吸附[5]；樊霆等从某锌尾砂坝土壤中筛选分离得到一株对锌具有较强抗性的菌株AspergillusflavusCTB430-1，锌对该菌株的最低抑菌浓度为800 mg/L[6]；王慧萍等从江西德兴铜矿重金属污染土壤中筛选得到一株菌株Sphingomonassp.DX-T3-03，可以抗25 mmol/L的锌[7]；李慧芬等从铅锌尾矿区与污水灌溉区土壤中筛选到一株抗锌的菌株StreptomycesciscaucasicusCCNWHX 72-14，对锌的抗性达到845 mg/L[8]；李进等从湖南资兴铅锌矿区的尾砂矿矿渣中筛选到菌株VerticilliuminsectorumJ3，在最佳条件下对锌的去除率为87.7%[9]。因此，从重金属污染区土壤中分离耐性菌株用于治理重金属污染，已成为生物修复生态环境的有效途径[10-12]。
本研究从甘肃省某造纸厂排污口污水处，长期受重金属污染的土壤中筛选出一株具有抗锌能力的菌株，通过其生理生化特征和16S rRNA基因系统发育分析鉴定该菌株，通过不同碳源、氮源和金属离子对其菌株HXZ-1生长影响的研究，探讨该菌株的生长特性，为该菌在重金属污染的微生物修复技术中提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1样品采集
菌株由本实验室分离纯化所得，样品采自甘肃省某造纸厂排污口土壤的不同位置，装塑料袋密封保存，备用。
1.1.2试剂和培养基
分子操作中所用的酶、抗生素均购自大连宝生物工程有限公司，DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，其余试剂为分析纯。
LB培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 8.0，pH 7.0，固体培养基在上述培养基的基础上加入15 g/L的琼脂。
1.1.3仪器与设备
分析天平(FA2104N)、恒温振荡培养箱(HZQ-X400)、分光光度计(722 s)购于上海精密科学仪器有限公司；高压式蒸汽灭菌锅(YXQ-LS-50SII)购于上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超净工作台(SWCJ-1)购于苏州净化设备；离心机(IS-R)购于上海安亭科学仪器厂；Alpha凝胶成像系统(JS-780)购于上海思伯明仪器有限公司。
1.2方法
1.2.1耐锌菌株的驯化与分离
耐锌菌株的分离采用梯度压力驯化法[7]。称取10 g待测污水样品，加入100 mL无菌水中，30℃、150 r/min振荡培养24 h，使细菌充分悬浮。移取1 mL培养液至另一盛有新鲜的5%LB培养基(含100 mg/L的ZnCl2)的三角瓶中于30℃、150 r/min振荡培养5 d；移取l mL培养液至另一盛有新鲜的5%LB培养基(含200 mg/L的ZnCl2)的三角瓶中于30℃、150 r/min振荡培养5 d；培养后依次移入含300、400、500、600、700、800、900和1000 mg/L ZnCl2的5%LB液体培养基中于30℃、150 r/min振荡培养5 d。吸取适量菌液稀释涂布于含有500 mg/L ZnCl2的固体LB培养基上，于30℃下培养48 h，挑取长势良好的单菌落，经连续分离纯化后，得到具有锌抗性的菌株，编号为HXZ-1，将纯化的菌培养后于冰箱中保存备用。
1.2.2生理生化特征鉴定
菌株形态观察、生理生化试验等参照《常见细菌系统鉴定手册》[13]《Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology》[14]等进行。
1.2.3 16S rRNA基因PCR扩增及其测序
采用高盐法提取菌体的染色体总DNA[15]。以菌株的总DNA为模板，使用通用引物来扩增菌株的16S rRNA基因。5′端引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(Escherichiacolibases 8～27)，3′端引物为5′-TACCTTGTTACGACTT-3′(E.colibases 1507～1492)。50μL的反应体系：10×Buffer 5.0μL，MgCl2(25 mmol/L)4.0μL，dNTP(2.5 mmol/L)4.0μL，引物(1 mmol/L)各1.0μL，DNA模板(50.0 ng/μL)1.0μL，Taq酶(5.0 U/μL)0.5μL，超纯水33.5μL。PCR反应条件：94℃预变性2 min；94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，共30个循环；最后，72℃再延伸10 min。取PCR产物于0.75%的琼脂糖凝胶上电泳。PCR产物由上海生工生物工程有限公司完成测序。
1.2.4菌株HXZ-1对不同碳源利用试验
试验测定的碳源分别为：葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉、甘露醇、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖。在无碳源培养基中分别加入不同碳源使其终浓度为0.5%。将菌株HXZ-1按3%(V/V)的接种量接种到装有20 mL不同碳源培养基的三角瓶中，于30℃、150 r/min培养12 h，在600 nm下测吸光值，每个试验设计3个平行，取平均值。
1.2.5菌株HXZ-1对不同氮源利用试验
试验测定的氮源分别为：酵母粉、蛋白胨、硝酸钠、硝酸铵、尿素、亚硝酸钠、草酸铵。在无氮源培养分别加不同氮源使其终浓度为0.5%，将菌株HXZ-1按3%(V/V)的接种量接种到装有20 mL不同氮源培养基的三角瓶中，于30℃、150 r/min培养12 h，在600 nm下测吸光值，每个试验设计3个平行，取平均值。
1.2.6不同锌离子浓度对菌株HXZ-1生长的影响
在50 mL三角瓶中分别装入20 mL LB培养基，于120℃灭菌30 min。在培养基中加入ZnCl2母液，使其终浓度分别为0、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000和1200 mg/L，以1%的接种量分别接入处于对数生长的种子液，设置空白对照(不添加任何金属离子)，于30℃，150 r/min培养11 h取样，在600 nm下测吸光值，所有实验设3个平行，各样品均设不接菌的空白对照。
1.2.7菌株HXZ-1在不同锌离子浓度下的吸附试验[16]
1.2.8菌株HXZ-1在不同培养时间对锌离子的吸附试验[17]