不同碳源、氮源和金属离子对耐锌菌株的生长特性的影响（二）
2结果与分析
2.1耐锌菌株HXZ-1的筛选
样品经过多次驯化培养后，吸取适量菌液稀释涂布于含有800 mg/L ZnCl2的固体LB培养基上，于30℃下培养48 h，得到一株长势良好的菌株，编号为HXZ-1，在LB固体平板上生长24 d后形成乳黄色、不透明、边缘整齐、表面隆起、湿润光滑、易挑起的圆形菌落(如图1-A和1-B)，革兰氏染色为阳性(如图1-C)，无鞭毛，不运动，不产芽孢。
2.2不同锌离子浓度对菌株HXZ-1生长的影响
通过菌株HXZ-1在不同浓度的锌离子液体培养基中的生长状况，了解菌株对不同锌离子浓度的耐受性情况。如图2所示，当锌离子浓度为1200 mg/L时，OD600为0，菌体生长被完全抑制；当锌离子浓度为50 mg/L时，OD600最大，为0.895。从总体趋势来看，随着锌离子浓度的逐渐增大，OD600的值先升高后降低。这说明，低浓度的锌离子(50 mg/L)对菌株HXZ-1生长均有刺激作用，而锌离子浓度高于50 mg/L时会对菌株HXZ-1生长有抑制作用，抑制作用随浓度增加而增大。这可能是由于高浓度的锌离子对菌株有一定的毒性，导致新陈代谢活性和生长量降低[6]。据报道，菌株耐锌浓度为1～10 mmol/L时为中度耐锌细菌，而耐锌浓度超过10 mmol/L为抗锌细菌[18]，菌株HXZ-1能耐受锌离子的最高浓度为1000 mg/L，因此可以判断出菌株HXZ-1为抗锌细菌。
图1菌株HXZ-1在LB固体培养基上的菌落形态(A)及其革兰氏染色(B)的结果
图2不同锌离子浓度对菌种HXZ-1生长的影响
2.3 16S rRNA基因扩增
菌株HXZ-1的基因组DNA提取结果见图3，基因组DNA在电泳图上的23 130 bp附近一条明显的条带，可以用于PCR扩增，16S rRNA序列扩增长度为1500 bp左右。
2.4 16S rRNA基因序列的测定及系统发育分析
根据16S rRNA基因的测序结果，将其序列与EzTaxon-e server(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)数据库中16S rRNA基因序列进行同源性比较，选择其中的12株菌的16S rRNA基因序列用于系统发育学分析，采用CLUSTAL_X将菌株XHZ-1的16S rRNA基因序列与其同源关系相近的序列比对分析后[19]，把两头的序列剪切整齐，用MEGA version 5.0软件包中的Kimura-Parameter Distance模型计算进化距离，用Neighbor-Joining构建系统进化树[20]，1000次随机抽样，计算自引导值(Bootstrap)以评估系统进化树的置信度。结果如图4，菌株HXZ-1所得16S rRNA基因序列与其序列相近的菌株都在Promicromonospora属，与模式菌株PromicromonosporaflavaCC 0387T具有最高的相似性为98.46%，结合前述的菌株形态特征，可以鉴定该菌株HXZ-1为原小单孢菌属(Promicromonosporasp.HXZ-1)。
图3菌株HXZ-1的基因组DNA、16S rRNA基因的PCR扩增
图4菌株HXZ-1的系统发育分析
2.5菌株HXZ-1对不同碳源利用试验
不同碳源对菌株HXZ-1生长影响的结果如图5所示。不同的微生物利用糖、醇、有机酸、脂肪酸等的能力有很大的差异，这是菌株鉴定中的一项重要指标。在以NH4NO3作氮源的情况下，供试的8种碳源中：菌株HXZ-1对葡萄糖、甘露醇和蔗糖的利用较好，其中对葡萄糖利用最好，OD600值最大，为0.771；对淀粉、阿拉伯糖和麦芽糖利用较差，说明菌株HXZ-1的最适碳源为葡萄糖。
图5不同碳源对菌株HXZ-1生长的影响
2.6菌株HXZ-1对不同氮源利用试验
不同氮源对菌株HXZ-1生长影响的结果如图6所示。不同的微生物利用氮源的能力有很大的差异，也是菌株鉴定中的一项重要指标。在以葡萄糖作碳源的情况下，供试的7种氮源中：菌株HXZ-1对2种有机氮源蛋白胨、酵母粉利用较好，而对硝酸钠和亚硝酸钠的利用较差，当蛋白胨作为氮源时，OD600值最大，为0.728；说明菌株HXZ-1的最适氮源为蛋白胨。
图6不同氮源对菌株HXZ-1生长的影响
2.7菌株HXZ-1对不同浓度锌离子的吸附试验
菌株HXZ-1对不同浓度锌离子的吸附率如图7所示。微生物对不同浓度的金属离子的吸附能力有很大的差异。从总体趋势来看，随着锌离子浓度的增大，菌株HXZ-1对锌离子的吸附率先升高后降低。在0～50 mg/L，随着锌离子浓度的增加，菌株HXZ-1对锌离子的吸附率呈上升趋势；当锌离子浓度大于50 mg/L时，吸附率逐渐减小，当大于200～1000 mg/L之间，吸附率较低。当锌离子浓度为50 mg/L时，菌株HXZ-1对锌离子的吸附率最大，为29.1%，这可能与菌株HXZ-1在含有50 mg/L的LB培养基中生长良好有关。
2.8菌株HXZ-1在不同时间内对锌离子的吸附试验
微生物在不同生长时间内对金属离子的吸附能力有很大的差异，在培养体系中锌离子浓度为500 mg/L时仍能生长的细菌，被认为是耐锌性较强的微生物[18]。当锌离子浓度为500 mg/L时，菌株HXZ-1在不同培养时间对锌吸附率的结果如图9所示。总的来看，随着培养时间的延长，菌株HXZ-1对锌离子的吸附率先升高后降低。该菌株HXZ-1在0～4 h内，吸附率上升趋势较慢；在4～10 h内，吸附率上升趋势较快；当培养时间大于10 h时，菌株HXZ-1对锌离子的吸附率开始下降。试验表明，当菌株HXZ-1的培养时间为10 h时，菌株HXZ-1对锌离子的吸附率最大，为18.8%。
图7培养基中不同锌浓度时菌体HXZ-1对锌吸附率的影响
图8菌株HXZ-1在不同培养时间对Zn2+吸附率的影响
3结论
本研究从某造纸厂的污水中筛选到一株对锌具有抗性的菌株HXZ-1，对其进行生理生化研究和系统发育分析，将其鉴定为原小单孢菌属(Promicromonosporasp.HXZ-1)。当前，抗锌菌株报道较多，主要在Aspergillus,Penicillium,Sphingomonas,Streptomyces和Verticillium等属[5-9,21]，尚未在Promicromonospora属有抗锌菌株的报道。因此，Promicromonospora属抗锌菌株的分离，为锌污染区域的微生物修复提供了新的菌种资源。
菌株HXZ-1在锌离子浓度为50 mg/L的LB培养基中生长良好，能耐受锌离子的最高浓度为1000 mg/L。菌株HXZ-1在葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源生长最好。当菌株HXZ-1在此最优培养条件下生长，锌离子浓度为50 mg/L时，菌株HXZ-1对锌离子的吸附率最大，为29.1%；当锌离子浓度为500 mg/L时，培养时间为10 h时，菌株HXZ-1对锌离子的吸附率最大，为18.8%。因此，菌株HXZ-1是一株对锌有较强抗性和吸附性的细菌，在重金属锌污染区域的微生物修复中有着良好的应用潜力。