新一代益生菌Akk在两种培养基中的生长情况与差异性代谢组学分析结果（二）
2.3组间差异分析
本研究结合单变量统计分析和多维统计分析方法，筛选Akk在两种培养基中的显著性差异代谢物，对正、负离子模式下检测到的显著性差异代谢物进行分析。
单变量统计分析
在进行两组样本间的差异分析时，常用的单变量统计分析方法包括差异倍数（FC）分析、T检验/非参检验。基于单变量分析，对正、负离子模式下检测到的所有代谢物（含未被鉴定的代谢物）进行差异分析，筛选出FC＞1.5或FC＜0.67，P＜0.05的差异代谢物共902种，其中正离子模式下670种，负离子模式下232种。将这些差异代谢物用火山图的形式表示，结果如图4所示。
如图4所示，每个圆圈代表一个特定的代谢产物，优化后相对优化前，红色为显著上调的代谢产物（FC＞1.5，P＜0.05），蓝色为显著下调的代谢产物（FC＜0.67，P＜0.05），圆圈越靠近左右两边和上边，差异性越显著，黑色为非显著性差异代谢物。之后研究均针对红色和蓝色圆圈代表的显著性差异代谢物。
多维统计分析
多维统计分析可以从总体水平反映组间差异以及组内的变异度，常采用的方法包括PCA和OPLS-DA。将鉴定到的所有代谢物重新线性组合得到PCA模型，采用PCA方法，能从总体上反映样本的总体分布趋势和组件样本的差异度。两组样本的PCA得分图如图5所示。
图5中椭圆代表95%置信区间，同一颜色的点表示组内的各个生物学重复，由点的分布状态可以看出，该模型可以区分两组样本，组间样本的数据点很好地集中在一起。PCA模型参数R2X越接近1表明模型越可靠，正、负离子模式下的模型解释率R2X分别为0.835和0.855。结果表明该模型稳定可靠，实验重复性好，随机误差较小，可进一步对样本进行差异性分析。
OPLS-DA得分图及OPLS-DA置换检验如图6所示，t[1]能最大程度反映组间差异，而to[1]则反映组内变异。可以看出OPLS-DA模型可显著区分两组样本，且组内差异较小，结果与PCA模型一致。经7次循环交互验证得到模型评价参数R2Y、Q2，通常情况下Q2＞0.5即表明模型稳定可靠。该模型正、负离子模式下的Q2分别为0.998、0.999，均大于0.5。在置换检验中，随着置换保留度逐渐下降，随机模型的R2和Q2均逐渐下降，说明原模型不存在过拟合现象，模型稳定性良好。
筛选差异代谢物
OPLS-DA模型得到的变量权重值（VIP）表示变量投影重要度，值越大，表示越重要。本实验以VIP＞1和P＜0.05为显著性差异代谢物的筛选标准，正离子模式下筛选到670种显著性差异代谢物，负离子模式下筛选到232种显著性差异代谢物，由于筛选到的差异代谢物过多，且表格无法直观地显示这些代谢物的FC，因此，选择VIP值前50的差异代谢物，以柱状图形式展示鉴定到的显著性差异代谢物的FC变化，结果如图7所示。可以看出，与硫乙醇酸盐液体培养基相比，Akk在优化培养基中发酵后，正离子模式下22种代谢产物显著上调，28种代谢产物显著下调，负离子模式下显著上调代谢产物22种，显著下调代谢产物28种。后续将对这些显著性差异代谢产物进行分析。
2.4聚类分析
为了更全面直观地显示样本之间的关系以及代谢物在不同样本中的表达模式差异，将VIP值前50的显著性差异代谢物用层次聚类进行聚类分析，结果如图8所示。聚在同一簇内的代谢物具有相似的表达模式，可能具有相似的功能或者共同参与同一代谢过程或者细胞通路。
Akk发酵优化培养基产生的代谢产物中，显著上调的代谢产物有肌酸、2-哌啶酮、2-氨基-1-苯乙醇、乙酰磷酸酯、烟曲霉素、巴多昔芬、N-乙酰-L-蛋氨酸、柠檬酸盐、甘露糖和各种多肽等，这些代谢产物在人体疾病的调控中发挥着重要作用。文献结果表明，Akk的这些代谢产物是该菌在缓解肠道炎症，治疗癌症、神经系统等疾病主要功能因素。
显著下调的产物有：乌头碱、苯甲酰乌头原碱、烟酰胺、高三尖杉酯碱、灵芝酸、尿苷、焦谷氨酸、海藻糖、龙胆苦苷等。其中，乌头碱是有毒植物中存在的一种毒性成分—二萜类生物碱，毒性极强，具有心脏毒性、神经毒性、生殖毒性、胚胎毒性，同时能通过血液吸收危害肝脏、肾脏等靶器官。实验结果发现优化培养基中的乌头碱显著下调，说明Akk在优化培养基中发酵能更大程度发挥预防及治疗心血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病的作用。除此之外的Akk代谢产物均被发现有一定抗炎、抗肿瘤、抗肥胖等益生功效，但是优化培养基中这些产物均有不同程度的下调，因此表明，补充Akk活菌制剂时应注意其有效菌数，过多的活菌数可能带来疾病风险。也有研究提出，补充灭活Akk可显著改善超重/肥胖的胰岛素抵抗者的多项代谢指标，且安全性良好，效果优于Akk活菌，由此为其作为后生元提供了有效证据。
2.5 KEGG通路注释与分析
在生物体内不同代谢物需要相互协调行使其生物学功能，基于KEGG通路分析有助于更进一步了解其生物学功能。为了解Akk在不同培养基中代谢产物含量变化的机制，将正负离子模式下检测到的显著性差异代谢物整合后进行KEGG通路注释，并根据P值选择显著性最高的前20条KEGG通路进行富集，富集结果以气泡图的形式显示，结果如图9所示。
富集最显著的5个通路为蛋白质的消化和吸收、氨酰基tRNA生物合成、胆汁分泌、ABC转运蛋白、氨基酸生物合成。其中，蛋白质的消化和吸收通路富集最为显著，强调蛋白质是Akk的第一营养需求，因此培养基优化主要针对这一需求进行。在这些通路中，蛋白质的消化和吸收、胆汁的分泌是Akk消化系统中的代谢通路，氨酰基tRNA生物合成在Akk的遗传信息处理中发挥重要作用，ABC转运蛋白涉及到Akk的膜运输功能，对外界环境的信息进行处理，氨基酸生物合成则可合成多种氨基酸。
除胆汁分泌通路外，其余4种代谢通路均富集到了多种氨基酸，人体所需的多种必需氨基酸包含其中，这些氨基酸均由培养基中的氮源即卵清蛋白和酪蛋白胨代谢得到。富集到胆汁分泌通路上的代谢物有20种，这些代谢物包括茚地那韦、依托泊苷、普伐他汀、多西紫杉醇、阿昔洛韦、乌本苷、长春花碱等，其中茚地那韦是一种选择性、强效和特异性的HIV蛋白酶抑制剂，目前用于治疗获得性免疫缺陷综合征，还能显著减轻链脲佐菌素诱导的阿尔兹海默症（AD）相关的记忆缺陷，而相关研究表明，AD大鼠模型中，Akk可减轻AD大鼠的认知障碍。依托泊苷、多烯紫杉醇、长春花碱等均为有效的抗肿瘤和抗癌药物，可应用于相应的癌症治疗。此外一些研究也证实了Akk在肺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等的治疗中发挥了重要作用。因此表明，其胆汁分泌通路可能是Akk发挥其功效的重要通路之一。
蛋白质的消化和吸收通路中富集到了一种短链脂肪酸——丙酸，它除能维持肠道健康、缓解肠道炎症外，在人体其他组织和器官中也可发挥重要作用，膳食中补充丙酸可通过抑制食欲提高胰岛素敏感性，并增加能量消耗防止高脂饮食引起的肥胖。据报道，Akk在体外培养时主要代谢产物为丁酸和丙酸，而在优化培养基发酵后丙酸呈现显著上调，一方面说明该培养基更有利于Akk发挥改善肠道疾病、减肥等作用。但目前也有报道，机体内有机酸累积与类风湿性关节炎有关。由此也表明，肠道中Akk活菌数量应保持一定上限，否则会带来不良健康影响。
Akk发酵优化培养基通过影响其代谢通路，这些代谢通路产生代谢产物较硫乙醇酸盐液体培养基显著上调，一方面表明该培养基组分能使Akk更好地发挥抗肿瘤、调节机体免疫、缓解肠道炎症等益生功能，另一方面，显著下调的代谢产物则从侧面说明如果肠道内Akk丰度过高可能带来某些疾病风险，如增加骨关节炎及类风湿性关节炎等患病风险等，且如果人体本身患有肠道炎症补充Akk活菌反而会加重病情。
结论
目前已知Akk与人体某些疾病存在重要关联，但至今为止将其工业化高密度培养依然存在技术难题。本研究对硫乙醇酸盐培养基进行了优化，筛选出了适合工业化生产的培养基配方，并通过非靶向代谢组学技术比较分析了Akk发酵优化培养基和硫乙醇酸盐液体培养基产生的代谢产物之间的差异，这些代谢产物与Akk发挥抗炎、抗癌、调节肠-脑轴和肠-肝轴等功能密切相关；将这些差异性代谢物进行KEGG通路富集，发现Akk的蛋白质消化和吸收通路富集最为显著，证明了影响该菌生长的最重要因素是蛋白质，同时也表明以此对培养基进行优化的合理性。为该培养基在工业化生产中应用提供了依据，也为将来Akk高密度培养以及作为后生元的可能性提供了研究和应用基础。