豨莶草果实内生细菌分离、鉴定、生长特性、抑菌效果及药敏分析（一）
豨莶草有多种药用价值，旨在从豨莶草果实中分离和筛选出高拮抗活性的内生细菌。采用了形态学观察、生理生化试验、16S rRNA序列比对、系统发育树分析以及OD600值、药敏试验和超滤等方法对该抗感染细菌C-5-1进行了相关生物学特性评价。结果显示，C-5-1为侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus），对多种病原细菌均敏感，尤其是对铜绿假单胞菌；低pH和高NaCl盐度环境中耐受性有限，在pH≤5.0或盐度≥15%时其生长受到了完全的抑制甚至是死亡，但在pH范围7.0-11.0和盐度范围0-5%下均能生长良好，说明该菌株为耐碱，但不耐酸和盐；筛选出了对菌株C-5-1高度敏感而对5种指示病原菌耐药的抗生素，即氨苄西林；C-5-1发酵上清液中存在着两种抗菌物质，且它们的相对分子质量均小于2 000。因此豨莶草有着优良微生物资源，可以成为开发抗感染细菌药物的重要资源。
微生物已经成为新型抗感染药物的重要来源之一。并且随着分离技术的不断进步，分离水平的不断发展，更多的微生物可能会被人类发现利用。经研究发现，植物内生菌存在于各种药用植物中，菌株分布广种类多，且在与宿主长期进化过程中，形成了产生某些与宿主植物有着相同或者相似药用价值能力的化合物。因此，药用植物内生菌是一类具有重大开发潜力的微生物资源。
豨莶草为菊科植物的干燥地上部分，味苦、辛，性寒，小毒，归肝肾经，可以祛风湿、通经络、清热解毒，治风湿痹痛、筋骨不利、腰膝无力、半身不遂、高血压、疟疾、黄疸、痈肿疮毒、风疹湿疮、虫兽咬伤。近年来，国内外学者对豨莶草的研究越来越重视，但有关其内生菌资源的研究至今未见报道。
本研究以豨莶草中筛选分离得到的具有抗感染活性的内生细菌菌株为研究对象，并阐述其相关生物学特性，旨在为进一步研究该菌株的抗感染代谢产物提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1药用植物
所用材料为无病虫害、刚成熟的豨莶草果实，采自河南省洛阳市汝阳县岘山。
1.1.2指示菌
5种病原细菌均由河南科技大学第一附属医院检验科细菌室提供。
1.1.3主要试剂
实验中使用的PCR酶和DNA Marker购自大连宝生物公司；两性霉素B购自上海生工；7种药敏片（浓度均为30μg/片）购自北京赛为思生物技术开发中心；微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司；其他化学试剂购自国药集团。
1.1.4培养基组分
内生细菌分离采用改进的LB琼脂培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10，葡萄糖5，琼脂粉20。液体发酵采用改进的LB液体培养基。为抑制真菌生长，以上培养基使用前，均需加入终浓度为50μg/mL的两性霉素B（用二甲基亚砜溶解）。
1.2方法
区域内出露的地层主要为太古界太华群、中元古界长城系熊耳群、蓟县系高山河群、新元古界官道口群、中生界白垩系、新生界古近系、新近系和第四系等，其中太古界太华群在区域北部出露，构成本区古老的结晶基底，主要由一套变质达角闪岩相的中深变质岩及少量混合岩组成，为本区金矿物质的主要来源之一。
1.2.1内生细菌的分离与纯化
内生细菌的分离是通过组织表面消毒来去除表生菌，具体操作如下：取新鲜豨莶草果实，用自来水洗净，消毒纸吸干，灭菌刀片去皮，然后用无菌水再清洗一遍，接着用75%乙醇浸泡3 min后，用0.1%氯化汞漂洗1-2 min，最后用无菌水冲洗3次并吸干。将消毒后的果实切成6 mm大小的组织块，种植于LB琼脂平板上，于37℃静置培养24 h，挑取少许划线接种到新的LB琼脂培养基上，反复纯化至单一纯菌落，置于4℃冰箱保存待用。为检测试验材料表面是否彻底消毒，取以上最后1次无菌水冲洗液涂布于LB平板上，于同等条件下培养作为对照，如对照平板无菌落长出即表明消毒彻底，后续试验所分离到的细菌来自果实内部，即为内生菌。
1.2.2拮抗细菌的筛选
以病源细菌——金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌和嗜麦芽窄食单胞菌为指示菌，采用平板对峙法，每一种待测纯菌落需做3次重复。无菌条件下，取100μL指示菌悬液（1×107CFU/mL）均匀涂布于LB平板上，将每个平板均分成4等份，20 min后将直径约为6 mm的待测菌块（琼脂）贴附于指示菌平板中央（每一等份），37℃培养24 h，观察各培养板指示菌的生长状况及抑菌圈大小（包含菌块直径6 mm，下同），同时作阳性对照（以氯霉素药片代替菌块）。各菌株拮抗效果的判定标准为：抑菌圈直径＞15 mm为高度敏感，抑菌圈直径11-15 mm为中度敏感，抑菌圈直径7-10 mm为低度敏感，无抑菌圈者为不敏感。
1.2.3菌种鉴定
（1）形态学鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》，革兰氏染色和芽孢染色光学显微镜镜检，记录其显微形态。（2）生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》，对待测菌株进行相关生理生化指标测定（微量生化鉴定管）。（3）分子鉴定：将待测菌株接种于LB液体培养基中，37℃摇床过夜培养，CTAB法提取基因组，细菌16S rRNA基因通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3'）和1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3'）对提取的基因组DNA进行PCR扩增。所得PCR产物送至上海生工测序。在NCBI数据库上进行序列相似性分析，再利用MEGA 5.1软件构建系统发育进化树。
1.2.4药敏试验
为了后续试验的开展，本研究需要对待测菌和5种指示菌做药敏试验。结合指示菌的临床药敏试验结果，选取了6种药敏片，即头孢他啶、头孢噻肟、复方新诺明、氨苄西林、青霉素以及四环素。
1.2.5生长特性分析
待测菌经LB液体活化3次，取活化好的种子液以1%的接种量分别接种到不同pH梯度（3.0、5.0、7.0、9.0、10.0和11.0）和NaCl浓度（1%、2%、5%、10%、15%和20%）的LB液体培养基中，37℃培养12 h后，在600 nm波长下测定OD值，以上每个梯度分别设置3个重复（为了满足所测得的吸光度值与细菌浓度成线性比例关系，本实验首先将不同梯度下的培养液进行稀释至OD600=0.3-0.7，然后将所测得的具体数值乘以稀释倍数即为该梯度下的OD600值）。
1.2.6抗菌代谢产物的初步纯化
将待测菌株接入LB液体培养基中（50 mL），30℃，220 r/min振荡培养48 h。发酵液经离心（8 000 r/min，10 min）去除菌体得上清，然后用等体积的乙酸乙酯萃取3次，有机相和水相分别经旋转蒸发浓缩至干，用2 mL无菌水将其溶解，取200μL测量对指示菌的拮抗活性，重复操作3次。将有抗菌活性的水溶液依次经过截留相对分子质量（Mr）为10 kD、5 kD和2 kD的超滤离心管，4℃，12 000 r/min下离心30 min，分别收集相应的滤出液及截留液，放入-70℃冰箱冻存，并进行冷冻干燥，得到的冷冻干燥粉末-70℃保存备用。使用前再将干燥粉末加入中2 mL无菌水，分别获得滤出液及截留液。
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