高效萘降解菌N-3生长曲线、脱氢酶活性的测定——摘要、实验部分
从柴油污染土壤中筛选分离出一株萘降解菌N-3，进行了菌种鉴定及萘双加氧酶基因（nah）验证，并考察了该菌对不同种类多环芳烃（PAHs）的降解能力及降解过程中脱氢酶活性的变化。实验结果表明：该菌为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），含有nah基因；当分别对液体培养基中质量浓度为50 mg/L的萘、菲、蒽、芘、芴降解84 h时，菌株N-3对萘、菲、蒽、芘、芴的降解率分别为28.81%，34.83%，36.65%，27.50%，23.47%。菌株N-3的脱氢酶活性与其对不同PAHs的降解率呈一定的正相关性。该菌不仅能有效降解萘，且对其他种类PAHs也有一定降解作用。
多环芳烃（PAHs）是一类含有两个或两个以上苯环的芳香族化合物。近年来，随着人类生产活动的加剧，环境中的PAHs大量增加。由于PAHs具有疏水性强、相对分子质量高、稳定性好、毒性大、难降解、在环境中存在时间长、具有潜在致癌性等特点，被很多国家列为优先控制污染物。土壤中的PAHs主要来源于污水灌溉、大气沉降和工业渗漏等。PAHs被土壤粒子吸附后，可经农作物富集而进入食物链，威胁人类健康。此外，土壤中的PAHs还可进入大气和水体，造成二次污染。目前，微生物法是降解PAHs最有效的方法之一。该法通过微生物的生长代谢等过程将有毒、难降解的有机物转化成无毒无害的化合物，安全经济且对环境无二次污染。近年来已有多名学者分离筛选出不同种类的萘、菲、蒽、芘、芴等PAHs的降解菌。
本工作从柴油污染土壤中筛选、分离出一株高效萘降解菌N-3，对其进行了菌种鉴定及PCR扩增实验，并考察了该菌株对单一萘、菲、蒽、芘、芴的降解能力及降解过程中脱氢酶活性的变化。
1实验部分
1.1试剂、材料和仪器
萘、菲、蒽、芘、芴、氯化三苯基四氮唑（TTC）：纯度均为99%，Sigma-Aldrich公司；正己烷：分析纯；葡萄糖：纯度为97%。
Tris-HCl缓冲溶液：三羟甲基氨基甲烷浓度为0.05 mol/L，pH=7.19。
土样：取自某市的柴油污染土壤。
LB培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0，121℃灭菌15 min，保存备用。
无机盐培养基：KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO40.5 g，CaCl20.01 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，蒸馏水1 000 mL，pH=7.0，121℃灭菌15 min，保存备用。
萘选择性培养基及PAHs降解培养基：分别用正己烷配制萘、菲、蒽、芘、芴质量浓度为1 g/L的有机溶液，过滤除菌，取一定量添加到无机盐培养基中，使萘、菲、蒽、芘、芴的质量浓度分别为50 mg/L，待正己烷挥发完毕后备用。
在上述培养基中分别加入质量分数为2%的琼脂，即得相应的固体培养基。
6010型紫外-可见分光光度计：惠普公司；全自动生长曲线分析系统，丹麦Biosense；GC-2010型气相色谱仪：日本岛津公司。GTR21-1型离心机：北京时代北利公司。
1.2萘降解菌的筛选
取10 g柴油污染土壤加入到100 mL无机盐培养基中，于温度30℃、转速170 r/min条件下浸取4 h，将浸取液在3 000 r/min下离心5 min，将10 mL上清液加入到100 mL萘选择性液体培养基中经4代富集培养（萘质量浓度从50 mg/L逐步提高到200 mg/L）后，取适量富集培养液，稀释涂布在萘选择性固体培养基平板上，待有明显菌落出现时从中选取大小、形态各异的菌落在LB固体培养基上进行进一步划线纯化分离。
将各纯化后的菌株分别接种于LB液体培养基中，于温度30℃、转速170 r/min条件下摇床培养20 h，培养液在转速6 000 r/min下离心，用生理盐水重悬浮并调节菌悬液在600 nm处的吸光度（OD600）为1，冷藏备用。
将各菌悬液按10%（φ）的接种量分别接种到萘选择性液体培养基中，观察其生长情况并测定培养液中的萘含量，实验设置3组平行试样。
1.3萘降解菌的鉴定
利用Baldwin等2003年报道的nah基因的简并引物nahf/nahr，对筛选出的菌株进行PCR扩增实验，用细菌DNA提取试剂盒（Tiangen）对菌株进行DNA提取。选择一株生长情况最好、对萘降解能力最强且含有nah基因的菌株作为萘降解菌。
菌株的鉴定工作委托中美泰和生物技术（北京）有限公司完成。
1.4萘、菲、蒽、芘、芴的降解
将萘降解菌的菌悬液按10%（φ）的接种量分别接种于100 mL含不同PAHs的降解培养基中，于温度30℃、转速170 r/min条件下摇床培养，定时取样，测定生长曲线及降解后培养液中各PAHs含量，实验设置3组平行试样。
1.5分析方法
1.5.1菌体浓度的测定
以菌体培养液的OD600值表征培养液中的菌体浓度。
1.5.2萘、菲、蒽、芘、芴质量浓度的测定
试样经正己烷萃取后，用气相色谱仪测定各PAHs的质量浓度。色谱条件：进样口温度300℃，检测器温度330℃，毛细管柱50 m×0.25 mm×0.25μm，柱温130℃保持3 min，以15℃/min的升温速率梯度升温至280℃，进样量1μL。
1.5.3脱氢酶活性的测定
通过测定微生物的脱氢酶活性可以了解微生物对有机污染物的氧化分解能力，具体方法：取2 mL降解后培养液于一系列具塞试管中，加入pH=8.5的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲溶液、0.1 mol/L葡萄糖溶液、0.5%（w）TTC各2 mL，置于30℃恒温培养箱中反应4 h。加入2滴浓硫酸中止反应，并准确加入5 mL甲苯，充分振荡，萃取。待反应生成的红色三苯基甲臜（TF）被完全萃取到有机相时，将有机相在4 000 r/min下离心5 min，过滤后测定滤液于486 nm处的吸光度（OD486），以此表征萘降解菌的脱氢酶活性。
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