红螯螯虾源布氏柠檬酸杆菌分离鉴定和耐药性分析（二）
1.6人工感染斑马鱼试验
试验所用斑马鱼购自杭州环特生物科技股份有限公司[生产许可证号:SCXK(浙)2022—0003]。试验在广西民族大学智能水产养殖室进行，在正式试验开始前，先将斑马鱼在1.0 m×0.8 m×0.4 m的养殖水箱中驯养14 d，以适应试验饲料和养殖环境。驯养结束后，取40尾体长(3.4±0.2)cm，体质量为(0.51±0.1)g的健康斑马鱼，随机分为4个组:1.5×108CFU/mL组、0.75×108CFU/mL组、1.5×107CFU/mL组和阴性对照组(前3个组统称为试验组)，每组10尾。1.5×108CFU/mL组处理方式:将分离菌株的单菌落转接至MH液体培养基，于37℃培养12 h，以麦氏比浊法稀释至浓度为1.5×108CFU/mL的菌悬液，取1 mL菌悬液用冷冻离心机于5 000 r/min离心2 min，弃上清，用0.9%生理盐水洗涤沉淀1～2次，重复离心操作1～2次，最后加入50μL 0.9%生理盐水，以50μL的剂量对斑马鱼进行腹腔注射。0.75×108CFU/mL组和1.5×107CFU/mL组参考1.5×108CFU/mL组制备不同浓度的菌悬液，阴性对照组注射50μL无菌0.9%生理盐水，连续观察7 d，期间每天观察记录斑马鱼的症状和死亡情况，并对死亡的斑马鱼进行检剖以及病原菌的分离和鉴定。
1.7细菌耐药性试验
采用K-B纸片扩散法检测分离菌株对25种抗菌药物的敏感性，判定标准依据美国临床和实验室标准研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)发布的标准，以抑菌圈直接大小作为敏感中介和耐药的判定标准，每个试验进行3次平行。
2结果
2.1细菌的鉴定
菌落形态观察:将纯化后的分离菌株接种于TCBS琼脂培养基，单菌落呈现不规则、不透明、表面有光泽、亮黄色，并呈现向外围扩散的生长趋势(图1A)。分离菌株革兰染色为红色短杆状(图1B)，将此株优势菌命名为171215-10。
图1分离菌株的菌落形态(A)和革兰染色(100×)观察(B)
生化鉴定:根据分离菌株171215-10的生化鉴定试验结果(表1)，结合《伯杰细菌鉴定手册》和Brenner等的研究，鉴定该菌株为布氏柠檬酸杆菌。
表1分离菌株171215-10的生化鉴定
16S rDNA鉴定:对分离菌株171215-10的16S rDNA基因进行PCR扩增和测序，并基于16S rDNA序列构建系统进化树，结果显示，分离株171215-10与布氏柠檬酸杆菌聚为一支(图2)。
图2基于16S rDNA序列相似性构建的系统进化树
菌株生长曲线:如图3所示，分离菌株171215-10在0～5 h处于延滞期，5～16 h处于对数快速生长期，16～30 h处于稳定期，30 h后开始进入衰亡期。
图3分离菌株171215-10的生长曲线
2.2人工感染斑马鱼试验
图4斑马鱼感染试验结果
结果如图4所示，1.5×108CFU/mL组斑马鱼在注射菌悬液后2 h开始出现死亡，至第2天时全部死亡，累计存活率为0%;0.75×108CFU/mL组斑马鱼在注射菌悬液后第5天不再死亡，累计存活率为30%;1.5×107CFU/mL组斑马鱼在注射菌悬液后第3天不再死亡，累计存活率为40%;阴性对照组第2天不再死亡，累计存活率为90%;分别从阴性对照组和各试验组死亡的斑马鱼体内分离得到菌株，经细菌鉴定，除阴性对照组外，其余各试验组菌株与注射菌株171215-10一致。