微生物生长曲线监测系统&光学延时显微镜用于快速评估吸湿性食品样品中的微生物质量
研究背景：本研究探索了一种基于光学延时显微镜（Optical Time-Lapse Microscopy）的快速微生物检测技术，用于评估吸湿性食品样品（如卡拉胶）中的微生物质量。这项研究由丹麦技术大学国家食品研究所和IntuBio ApS合作完成，旨在解决传统微生物检测方法在处理吸湿性食品时面临的挑战，并提供一种更快速、准确的替代方案。卡拉胶是一种从红藻中提取的水溶性胶体，广泛应用于食品工业中作为凝胶剂、增稠剂或稳定剂。
然而，其吸湿性特性使得传统的平板计数法在检测微生物污染时面临诸多问题，如样品膨胀、形成凝胶团块、堵塞移液管以及在琼脂平板上形成气泡和杂质，导致计数困难且容易出错。此外，传统平板计数法需要长达72小时的培养时间，这对于食品制造商快速释放产品和提高食品安全性提出了挑战。为了解决这些问题，研究团队开发了一种基于光学延时显微镜的检测方法，利用IntuGrow系统对微型平板（mini agar plates）进行实时成像和分析。该方法通过将卡拉胶粉末夹在两层琼脂之间，避免了样品膨胀对检测的影响，并通过DELAY算法对图像进行处理，消除了背景噪声和卡拉胶膨胀带来的干扰。
实验结果表明，该方法能够在12-20小时内完成检测，相比传统平板计数法（72小时）大大缩短了检测时间。研究团队对14种不同污染水平的卡拉胶样品进行了测试，结果显示，光学延时显微镜法与传统平板计数法之间存在几乎完美的相关性（Deming回归斜率为0.96），但存在-0.33 log CFU/g的偏差。这表明，尽管光学延时显微镜法能够快速、准确地检测微生物，但在某些情况下可能会低估微生物数量。此外该方法的检测限为50 CFU/g，略高于传统平板计数法（40 CFU/g），但其快速检测的优势使其在工业应用中具有巨大的潜力。总体而言，本研究成功开发了一种适用于吸湿性食品的快速微生物检测技术，能够显著缩短检测时间，提高检测效率和准确性。未来，该技术有望在食品工业中得到广泛应用，尤其是在需要快速评估微生物质量的场景中。然而，该技术在工业环境中的可重复性和操作简便性仍需进一步验证，以确保其在实际应用中的可靠性和稳定性。
丹麦Biosense微生物生长曲线监测系统的应用
将3D光学显微镜扫描系统oCelloScope置于培养箱（35°C）中，并将装有准备好的微型琼脂板的6孔板加载到系统中，以使用IntuGrow软件（Biosense Solution，丹麦）进行延时图像生长分析。按照先前报道的研究）经过一些修改。简而言之，在20 h内每小时生成每个孔的5670张图像。应用的技术设置为2 ms的照明时间、1.4 mm×1.05 mm的视场（FOV），聚焦深度为10μm，光学分辨率为1.35μm，光学放大倍数为4.0。成像从下方进行，由于各种角叉菜胶类型的吸湿能力，与在琼脂顶部观察到的不规则和变化的琼脂高度相比，在微型琼脂平板内获得了琼脂更平坦和光滑的一面。倾斜的（相对于水平面6.25°）光轴可以扫描微型琼脂板并形成图像堆栈。单个z平面的投影z堆栈图像是通过组合倾斜图像生成的。
实验结论
使用了光学延时显微镜技术（IntuGrow）在快速评估吸湿性食品（如卡拉胶）中的微生物质量方面具有显著潜力。与传统的平板计数法相比，该技术能够将检测时间从72小时缩短至12-20小时，大大提高了检测效率。Deming回归分析显示，光学延时显微镜法与传统平板计数法之间存在几乎完美的相关性（斜率为0.96），但存在-0.33 log CFU/g的偏差，表明传统平板计数法可能高估了微生物数量，而IntuGrow技术可能低估了微生物数量。这种偏差可能与卡拉胶的特性（如膨胀和抑制微生物生长）以及两种方法的样品制备方式有关。尽管IntuGrow技术在检测限（50 CFU/g）上略高于传统平板计数法（40 CFU/g），但其快速检测的优势使其在工业应用中具有明显吸引力，尤其是在需要快速释放产品以减少召回风险和提高食品安全性的情况下。此外该技术通过“夹心法”样品制备和DELAY算法，成功解决了卡拉胶膨胀和背景噪声的问题，能够有效区分微生物微菌落和卡拉胶引起的假阳性信号。
图1、均匀100×稀释的角叉菜胶样品的琼脂接种问题。A/B：角叉菜胶形成凝胶状结构和气泡，可能会被误解并算作菌落。这些通常存在于培养皿底部附近，而菌落则出现在琼脂的整个琼脂中。C/D：角叉菜胶会产生浑浊和浑浊的背景以及带有小颗粒和气泡的干扰结构，在早期孵育（24-48小时）和计数（72小时）期间，根据样品微生物群的不同，这些小颗粒和气泡可能会被误认为是小菌落。E/F：在5%的琼脂平板中观察到芽孢杆菌属的蜂群菌落，这使得这些平板无法计数或具有挑战性。
图2、使用Biosense微生物动态碱性系统的IntuGrow DELAY算法处理原始显微镜图像之前（A）和（B）之前（B）基于图像的微生物微菌落计数。微生物微菌落（用黄色圆圈标记的示例）在处理后的图片中显示为黑点，其中基于延时处理的DELAY算法将未生长的角叉菜胶碎片和气泡作为白点或灰色陨石坑（示例用红色虚线圆圈标记）。
图3、Biosense微生物动态监测系统基于图像的微生物计数允许在芽孢杆菌属蜂群开始覆盖其他菌落之前对微生物菌落进行计数。黄色圆圈表示菌落，由于蜂群，使用传统的终点计数不会对其进行计数。
图4、在IntuGrow处理（D、E、F）具有高、中和低微生物污染水平（从左到右）的原始图像（A、B、C）后，对角叉菜胶样品进行基于图像的计数。检测到的CFU数量和计算的CFU/g浓度如图D、E和F所示。
图5、14个角叉菜胶样品的细胞浓度（log CFU/g）比较。对原始商业角叉菜胶样品（A、B、C、D、E、F）以及通过角叉菜胶样品稀释（/稀释因子）或加标（s）获得的微生物浓度降低或增加的样品进行了测试。所有样品均在独立测试中进行了两次重复测试。A）所有测试的角叉菜胶样品和重复中的细胞浓度。B）为每种角叉菜胶类型获得的平均细胞浓度的Demings回归，具有完美的（x=y）相关线以进行视觉比较。C）比较IntuGrow和平板计数时平均CFU浓度的残差图。
总结
在食品行业，获得结果的时间对于更快地放行产品、最大限度地减少召回、缓解微生物污染问题以及最终实现食品安全至关重要。角叉菜胶是从红海藻（Rhodophyta）中分离出来的，由于其吸湿特性，它被用作各种食品和饮料中的胶凝剂、增稠剂、纹理剂或稳定剂。目前，标准的行业平板计数方法需要在与熔融琼脂混合之前将样品稀释100倍，以便在企业对企业运输之前评估角叉菜胶样品中的微生物污染水平。然而，即使在这种稀释下，角叉菜胶也会膨胀、形成团块、堵塞移液器，并在琼脂平板上留下厚厚的凝胶结构、气泡和碎屑，导致微生物计数具有挑战性并容易出现人为错误。
在这里，研究人员首次报道了由Biosense微生物生长动态监测系统内的IntuGrow解决方案监测的微型琼脂板的应用，以评估具有挑战性的食品成分中的微生物质量。在不稀释食品样品的情况下，将角叉菜胶粉末撒在两层平板计数琼脂之间，以在12-20小时内对细菌进行计数，而通过传统平板计数进行计数需要72小时。开发了一种用于光学延时显微镜（ocelloScope微生物动态监测系统）的DELAY算法，并将其添加到IntuGrow分析软件中，以通过使用以前的图像对背景进行归一化来抑制肿胀的影响并增强对生长微生物菌落存在的检测。延时显微镜基于图像的监测可以从角叉菜胶样品中获得结果，而由于细菌成群结队，传统平板计数无法获得的结果。
两种方法之间的比较显示0.96的近乎完美的Demings斜率，而观察到的-0.33 log CFU/g偏差表明IntuGrow计数低于传统平板计数。这可能是由于卡拉胶人工制品在后一个板块中被算作菌落。IntuGrow能够对角叉菜胶等具有挑战性的食品成分中的细菌进行计数，这意味着该技术应该易于应用于易于稀释的样品或非亲水胶体粉末。光学延时显微镜技术（Biosense微生物动态监测系统）在快速评估吸湿性食品中的微生物质量方面表现出色，未来有望在食品工业中得到广泛应用。其快速检测能力不仅能够提高生产效率，还能为食品安全管理提供更及时的决策支持。
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