适用于低盐发酵香肠葡萄球菌与乳酸菌生长特性及产酸能力测定及筛选（二）
1.3方法
1.3.1菌株分离与纯化
无菌操作下称取10 g绞碎的样品，转移至100 mL无菌生理盐水中，振荡（200 r/m，30 min）混匀；静置数分钟，再取1 mL加入到9 mL无菌生理盐水中，即成10-2稀释度，根据需要再依次稀释；选取合适稀释度的样品溶液，倒入相应的固体培养基中，混匀后37℃静置培养24～48 h；挑取单菌落反复划线，直至获得纯的菌株。其中，乳酸菌的分离采用含有3%CaCO3的MRS固体培养基，挑取具有溶钙圈的菌株；葡萄球菌的分离采用MSA固体培养基。
1.3.2菌株的初步筛选
对纯化后的菌株进行革兰氏染色、菌体形态观察，选择革兰氏阳性菌种保存。对所分离的革兰氏阳性菌分别进行如下筛选：
接触酶实验：将37℃培养过夜后的菌液用接种环涂抹于已滴有5%H2O2的玻片上，立即观察结果，3 min内出现气泡者为阳性反应，反之为阴性。
耐硝性实验：以1%的接种量将菌种分别接种于不同亚硝酸钠添加量（0、50、100、150 mg/kg）的液体培养基中，37℃培养48 h，于600 nm波长处测定吸光度。
产酸能力测定：以1%接种量将菌株接种于液体培养基中，37℃培养24、48 h后测定发酵液的pH值。
对于所分离的阳性球菌菌株，分别进行如下额外指标的筛选：
耐酸性实验：以1%的接种量将菌种分别接种于NB液体培养基（pH值调至5.0）中，37℃培养48 h，于600 nm波长处测定吸光度。
溶血实验：用接种针取37℃培养过夜后的菌液，在血平板上划线，37℃培养24、48、72 h后观察结果，有溶血圈出现的菌株为阳性，以金黄色葡萄球菌作为阳性对照。
硝酸盐还原酶活力测定：检查37℃培养过夜后菌液的硝酸盐还原情况，在白色搪瓷比色盘中加入1滴菌液，然后加入硝酸还原试剂A、B液各1滴，观察菌落周围出现的红圈大小和清晰度，显色反应后，挑出红圈直径＞1.2 cm的菌株。
1.3.3菌株的复筛
对初步筛选所得到的葡萄球菌及乳酸菌菌株进行进一步的筛选：
蛋白酶活性检测：将37℃培养过夜后的新鲜菌液分别点接种在脱脂牛乳平板培养基（SM）上，培养5 d。观察菌落周围透明圈的大小。
氨基酸脱羧酶实验：将37℃培养过夜后的菌液倾注到氨基酸脱羧酶检测培养基（分别含有0.5%酪氨酸、0.25%组氨酸、赖氨酸及精氨酸，以不添加氨基酸作为空白对照）中，37℃培养，变色则为阳性。
精氨酸双水解酶实验：将37℃培养过夜后的菌液倾注到精氨酸双水解酶检测培养基（含有1%L-精氨酸盐）中，37℃培养，培养基转化为红色者为阳性。
对于初步筛选得到的葡萄球菌菌株，分别进行如下额外指标的筛选：
脂肪酶活性检测：将37℃培养过夜后的新鲜菌液分别点接种在三丁酸甘油酯培养基（TB）上，培养5 d，观察菌落周围透明圈。
乙偶姻产生实验：接种葡萄球菌菌株于乙偶姻检测培养基，取培养液和40%NaOH等量混合。加少许肌酸，如果培养液10 min出现红色即为阳性反应。
对于所分离的乳酸菌菌株，进行抑菌实验作为额外的筛选指标：将乳酸菌菌株培养至约为108CFU/mL，点接种于已含有106CFU/mL的敏感指示菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌以及蜡样芽孢杆菌）的固体平板上，37℃培养12 h，观察菌落周围是否存在抑菌圈。
1.3.4菌株的分类学鉴定
形态学观察：将菌株平板划线于固体培养基上，观察菌落形态，挑取对数生长期的菌体进行革兰氏染色后显微镜下观察菌体细胞形态。
生理生化实验：参照《乳酸细菌现代研究实验技术》及《常见细菌系统鉴定手册》对筛选菌株的生理生化特性进行检测，包括精氨酸双水解酶实验、糖醇发酵实验等。
16S rDNA分子生物学鉴定：细菌基因组DNA按照试剂盒说明书步骤进行提取。以提取基因组作为PCR扩增的模板，利用通用引物Lpw57（5’-AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’）及Lpw205（5’-CTT GTT ACG ACT TCA CCC-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）为：10×Buffer 2.5μL、模板DNA 1μL、引物各2.5μL、dNTP 2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL、dd H2O 14.25μL，混匀5 min。PCR反应条件：94℃预变性5 min，94℃1 min、43℃30 s、72℃90 s，进行30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖电泳分析后由北京诺赛基因组研究中心测序。
系统发育树的构建：所得菌株序列根据NCBI网站的BLAST程序在GenBank数据库中进行比对鉴定，根据鉴定结果及相似性较高的几株菌的16S rRNA，利用MEGA软件进行菌株系统发育树的构建。
1.3.5菌株的生长特性及产酸能力测定
将菌株接种于相应的液体培养基，37℃培养（葡萄球菌接种在NB液体培养基中200 r/min振荡培养，乳酸菌接种在MRS液体培养基中静置培养），以液体培养基为空白对照，每2 h用紫外分光光度计于600 nm波长处测定吸光度，用酸度计测定菌液的pH值。
1.3.6菌株间拮抗性测试
用含乳酸菌的接种环，在低盐模拟肉汤固体培养基（NaCl质量分数2%）上划一直线接菌。37℃条件下培养48 h，待形成菌落后，沿菌落边缘（不接触）用接种环从垂直方向接种葡萄球菌；37℃条件下培养24 h，观察乳酸菌对于葡萄球菌的抑制效果。
1.4数据处理
所有实验均重复进行3次，使用SPSS 17.0软件对数据进行统计和方差分析，使用Excel软件对数据进行分析及作图。
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