适用于低盐发酵香肠葡萄球菌与乳酸菌生长特性及产酸能力测定及筛选（三）
2结果与分析
2.1优良葡萄球菌菌株初筛结果
从5种自然发酵食品中分离出平板培养形态不同的疑似菌株共56株，其中6株来自川味腊肉，4株来自欧力波兰萨拉米，1株来自广味挂肠，15株来自农家烟熏老腊肉，30株来自川味土猪腊肠。从疑似菌株中筛选出革兰氏阳性球菌、接触酶阳性菌39株，初步判定为葡萄球菌。
对所得的39株菌株的安全性进行溶血实验，结果表明，39株菌均为溶血实验阴性，说明分离的球菌均具有安全性。39株菌株中，所有菌株均可耐受50、100 mg/kg NaNO2，仅2株球菌对150 mg/kg NaNO2不耐受；其中34株菌具有硝酸盐还原酶，且其中的23株可耐受pH 5.0的酸度，经过初筛，得到发酵特性良好的优良葡萄球菌23株，作为下一步复筛的出发菌株。其中菌株L1、L2、L3来自川味腊肉，R1、R2、R3来自欧力波兰萨拉米，Z7、Z9、Z10、Z12来自农家烟熏老腊肉，C6、C7、C8、C10、C11、C16、C17、C23、C24、C25、C26、C29、C30来自川味土猪腊肠。
2.2优良葡萄球菌菌株复筛结果
表1葡萄球菌菌株复筛结果
对初筛所得的23株葡萄球菌进行复筛，由表1可知，其中有17株菌既不产氨基酸脱羧酶，也不产精氨酸双水解酶，这17株菌中有15株菌具有脂肪酶活性，14株菌具有蛋白酶活性，而既产蛋白酶又产脂肪酶的菌株有12株，其中有3株产乙偶姻。因此，最终筛选出3株具有优良风味特性的葡萄球菌，它们分别为筛选自川味腊肉的L2、筛选自欧力波兰萨拉米的R2以及筛选自农家烟熏老腊肉的Z9。
2.3优良乳酸菌菌株初筛结果
从6种自然发酵食品中分离出的平板培养形态不同的疑似菌共52株，其中25株来自郭三酸菜，7株来自欧力波兰萨拉米，5株来自北京紫光园自制酸乳，4株来自秦烹小院自制酸乳，7株来自渔夫南湘菜馆自制酸乳，3株来自一口酸牛奶（鼓楼东大街店）的自制乳酸菌饮料。从疑似菌株中筛选出具溶钙圈的革兰氏阳性、接触酶阴性乳酸菌30株。
所得30株乳酸菌菌株中，所有菌株均可耐受50、100 mg/kg NaNO2，其中有28株菌可耐受150 mg/kg亚硝酸盐。不同菌株的产酸情况差异较大，部分产酸较快菌株在MRS培养基中培养24 h，pH值可达3.67，其中21株菌的pH值可在24 h内降至3.70～3.90，产酸效果较好。经过初筛，得到发酵特性良好的优良乳酸菌21株，作为下一步复筛的出发菌株。其中菌株P1、P2、P4、P5、P6、P8、P9、P12、P15、P19、P20、P21来自于郭三酸菜，S1来自于欧力波兰萨拉米，SN1-1、SN1-2、SN1-3、SN1-5来自于北京紫光园自制酸乳，SN2-6、SN2-7、SN2-8来自于秦烹小院自制酸乳，X来自于一口酸牛奶自制乳酸菌饮料。
2.4优良乳酸菌菌株复筛结果
表2乳酸菌菌株复筛结果
对初筛所得的21株乳酸菌进行复筛，经过抑菌实验，所有菌株均对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、蜡样芽胞杆菌有抑制作用。由表2可知，根据抑菌圈的大小，其中10株乳酸菌的抑菌作用最强（抑菌圈平均宽度大于3 mm）。在进行复筛的21株菌中，氨基酸脱羧酶阴性的菌株有12株，精氨酸双水解酶阴性的菌株有18株，具有蛋白酶活性有7株。因此，最终筛选出4株兼具多种优良特性的乳酸菌菌株，分别为筛选自郭三酸菜的P6与P12、筛选自北京紫光园自制酸乳的SN1-3以及筛选自一口酸牛奶自制乳酸菌饮料的X。
2.5菌株的分类学鉴定结果
2.5.1菌株形态学鉴定结果
图1葡萄球菌菌落形态特征
由图1可知，葡萄球菌菌株L2、R2及Z9在NB固体培养基上37℃培养24 h，菌落直径约1～2 mm，菌落形态均呈白色圆形，不透明，形状规则，其中L2、R2菌落光滑、湿润、呈凸起状，Z9菌落边缘粗糙，质地干燥且菌落比较扁平。
图2葡萄球菌菌体形态学特征（×1 000）
由图2可知，经革兰氏染色后在显微镜下观察，葡萄球菌菌株L2、R2及Z9的菌体细胞均为圆球形，革兰氏阳性，其中菌株L2部分成对生长，菌株R2单个生长，菌株Z9呈不规则堆状排列。
图3乳酸菌菌落形态特征
由图3可知，乳酸菌菌株P6、P12、SN1-3及X在MRS固体培养基上37℃培养24 h，菌落直径约1～2 mm，菌落形态均为白色圆形，菌落表面光滑，湿润凸起，边缘规则，其中X菌落呈半透明状，P6、P12、SN1-3菌落均不透明。
图4乳酸菌菌体形态学特征（×1 000）
由图4可知，经革兰氏染色后在显微镜下观察，乳酸菌菌株P6细胞成对或成短链，革兰氏阳性，粗短杆状；菌株P12成对或成短链，为革兰氏阳性短杆菌；菌株SN1-3细胞部分以直二个方向形成四联排列，为革兰氏阳性球菌；菌株X成对或成短链，为革兰氏阳性杆菌。
2.5.2菌株生理生化实验鉴定结果
表3葡萄球?菌菌株生理生化实验结果
由表3可知，参考《常见细菌系统鉴定手册》，根据葡萄球菌生理生化鉴定结果，初步推断葡萄球菌菌株L2、Z9为腐生葡萄球菌，R2为肉葡萄球菌。
表4乳酸菌菌株生理生化实验结果
由表4可知，参考《常见细菌系统鉴定手册》和《乳酸细菌现代研究实验技术》，根据乳酸菌菌株的生理生化鉴定结果，初步推断乳酸菌菌株P6、P12为植物乳杆菌或鼠李糖乳杆菌、X为干酪乳杆菌、SN1-3为戊糖片球菌。
2.5.3菌株的16S rDNA分子生物学鉴定结果
图5菌株16S rDNA的PCR扩增产物电泳图
由图5可知，对菌株的16S rDNA序列采用通用引物进行扩增后，在1 000～2 000 bp之间可见到清晰明亮的条带，大小约为1 500 bp。
利用NCBI网站的BLAST程序对菌株16S rDNA测序结果在GenBank已知序列数据库中进行对比分析。结果表明：葡萄球菌菌株L2、Z9与腐生葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus）具有最高同源性，葡萄球菌菌株R2与肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）具有最高同源性；乳酸菌菌株P6、P12与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）具有最高同源性，乳酸菌菌株X与干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）具有最高同源性，乳酸菌菌株SN1-3与戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）具有最高同源性。选取与GenBank中相似性较高菌株的序列，利用MEGA 6.0软件进行系统发育树的构建，结果如图6～8所示。
图6葡萄球菌菌株L2、R2、Z9的系统发育树
图8乳酸菌菌株SN1-3的系统发育树
综合生理生化及分子生物学鉴定，结果表明，葡萄球菌菌株L2、Z9为腐生葡萄球菌，葡萄球菌菌株R2为肉葡萄球菌；乳酸菌菌株P6、P12为植物乳杆菌，菌株X为干酪乳杆菌，SN1-3为戊糖片球菌。