贝莱斯芽孢杆菌SW5菌株生长曲线测定及抑菌性能分析
浙江国际海运职业技术学院海洋旅游学院朱亚珠和宁波大学食品与药学学院夏率博，陈琳，刘洋，吴祖芳，翁佩芳从自然发酵海洋鱼酱油中分离得到了一株具有多种蛋白酶活性与糖酶活性的贝莱斯芽孢杆菌SW5菌株，为探究贝莱斯芽孢杆菌SW5的抑菌特性，研究了SW5菌株的生长及生理生化特性，验证了SW5菌株发酵上清液对食品中多种常见病原菌的抑制能力；并利用液相色谱-质谱联用技术鉴定了其中的抑菌物质。结果表明：菌株SW5在35℃、pH值5时生长最快，对于亚胺培南、头孢曲松等β-内酰胺类抗生素敏感。菌株SW5的发酵上清液具有明显的抑菌活性，上清液经过浓缩后抑菌效果显著增强。TOF-MS分析表明，发酵上清液中含有的抑菌物质为表面活性素、山茱萸苷A、氨基糖苷类抗生素庆大霉素与异帕米星、链霉菌素类抗生素达福普丁。研究结果以期为菌株SW5的进一步开发利用提供一定的理论基础。
芽孢杆菌是广泛存在于环境中的益生菌之一，在增强机体抗氧化能力，提高免疫力和改善生产性能等方面具有良好的效果[1]。贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)作为芽孢杆菌的一个新种，具有植物促生长、生物防治、制备生物修复剂及产生多种酶和抗菌物质等功能[2]，其中的抗氧化性与具有的载体物质胞外多糖[3]和活性肽[4]有关，可作为一种理想的微生物源抗氧化剂。全基因图谱分析显示[5-6]，B.velezensis基因组中含有srfAA、srfAB、ituC、bmyB、bioA及fen等多种脂肽类抗生素相关基因，且含有非核糖体多肽合成酶(NRPSs)基因簇，可指导合成多种常见的、具有广谱抑真菌活性的脂肽，如表面活性素(surfactin)、伊枯草菌素(iturin)、芬荠素(fengycin)等，这类脂肽类物质能够对真菌类植物病原体产生明显的拮抗作用[7-8]。B.velezensis对白菜黑斑病菌[9]、番茄灰霉病菌[10]、小麦赤霉病菌及小麦全蚀病菌[11]等多种植物病原菌具有拮抗作用，因此在农业上有作为生物抑制剂的潜能[12]。这些特性在食品行业中也具有一定的应用潜力，但鲜有报道。本团队前期研究中，从自然发酵海洋鱼酱油样品中分离得到了一株贝莱斯芽孢杆菌SW5(Bacillus velezensis SW5，以下简称SW5)菌株，具有较强的蛋白酶活性和较好的水解海洋鱼类蛋白的特性[13]。本研究进一步对菌株SW5的生长特性、生理生化特性及抑菌性能进行分析，并分离纯化和初步鉴定其发酵产生的抑菌物质，为SW5菌株在海洋蛋白质资源深度利用、食品保鲜与安全等方面的应用奠定理论基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
贝莱斯芽孢杆菌SW5及实验菌株(鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌)，宁波大学食品生物技术实验室保藏。
HCl、NaOH等(分析纯)及LB、TSB、NB培养基，上海国药集团化学试剂有限公司。
1.2仪器与设备
SW-CJ-2D型超净工作台，苏州净化设备有限公司;LDZX-40BⅠ型立式蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂;5804R型高速大容量冷冻离心机，德国Eppendorf公司;QY-2102C型全温振荡培养箱，宁波江南仪器厂。
1.3实验方法
1.3.1培养基配制
MOLP培养基[14](mg/L)：蛋白胨30 000、蔗糖20 000、酵母提取物7 000、KH2PO4 1 900、CuSO4 0.001、FeCl3·6H2O 0.005、Na2MoO4 0.004、KI 0.002、MnSO4·H2O 3.6、MgSO4 450、ZnSO4·7H2O 0.14、H3BO3 0.01、C6H8O7 10，pH值7.0。LB固体培养基(g/L)：NaCl 10、胰蛋白胨10、酵母提取物5、琼脂15。
1.3.2不同环境因素对菌株SW5生长影响的测定
在LB培养基中接种2%SW5菌株，30℃、200 r/min条件下培养3 d，分别测定不同温度(5、10、15、20、25、30、35、40、45、50℃)、pH值(3、4、5、6、7、8、9、10、11)、NaCl质量浓度(0、5、10、15、20、25、30 g/mL)对细胞生长的影响。细胞生物量的测定方法：分光光度计测定600 nm处吸光度，根据吸光度大小判断生长状态，每个实验平行重复3次。
1.3.3菌株SW5生长曲线的测定
将菌株SW5种子液(OD600约为1)，按2%接种量接种到含有50 mL LB培养基的三角烧瓶内，在不同时间取样，测定其在600 nm处的吸光度，然后以OD值为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制生长曲线。
1.3.4菌株SW5的抗生素抗性测定
将SW5菌株按2%接种量接种于TSA平板上，在平板中央打孔，加入一定浓度的EUCAST推荐的抗生素，在37℃培养24 h，测量透明圈直径，直径越大说明其对抗生素越敏感。
1.3.5菌株SW5发酵上清液的抑菌特性测定
选取食品中常见的8种病原菌(鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、福氏志贺氏菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌)为指示菌，取1 mL新鲜菌液加入100 mL的NB固体培养基中，迅速倒入培养皿中，作为指示菌平板。并在平板上用无菌打孔器打孔备用。取活化好的SW5菌株，按3%的接种量接种于MOLP培养基，在37℃、200 r/min的恒温培养箱培养24 h。8 000 r/min离心10 min，得到发酵上清液。取50μL发酵上清液加入指示菌平板的孔中，37℃下培养24 h，记录抑菌圈直径。
1.3.6浓缩发酵液抑菌活性的测定
在20 mL发酵上清液中加入10 mL的正丁醇，摇匀后离心，抽出有机相后再加入相同体积的正丁醇，重复抽提3次，得到30 mL有机相抽提液。将抽提液进行冷冻干燥，完全冻干后再加入2 mL无菌水溶解，得到浓缩15倍的发酵上清液。按1.3.5节方法测定发酵上清液的抑菌活性。
1.3.7发酵液抑菌物质鉴定
以浓缩后发酵上清液为原料，体积分数10%甲醇为溶剂，采用UHPLC-Q Exactive系统，鉴别出其中的抑菌物质[7]。色谱条件：色谱柱BEHC18(100 mm×2.1 mm，1.7μm)；流动相A为水(含体积分数0.1%甲酸)，流动相B为乙腈-异丙醇(体积比1∶1)(含0.1%甲酸)；流速0.40 mL/min，进样量10μL，柱温40℃。原始数据用代谢组学处理软件Progenesis QI(美国Waters Corporation)进行搜库鉴定，数据库来源为http:∥www.hmdb.ca。
2结果与分析
2.1贝莱斯芽孢杆菌SW5的菌落形态分析
将贝莱斯芽孢杆菌SW5接种在LB固体培养基上，观察其菌落形态，发现SW5菌株在LB培养基上的菌落形态为圆形或椭圆形，一般较大，颜色为不透明灰白色，表面有皱褶，菌落中心有凸起，该结果与钟丽娟等[15]分离的贝莱斯芽孢杆菌菌落形态类似。
2.2菌株SW5的生长曲线分析
贝莱斯芽孢杆菌SW5的生长曲线如图1。由图1可知，接种贝莱斯芽孢杆菌SW5后，延迟期为0～2 h，此时菌株生长缓慢；对数生长期为2～14 h，此时菌体数明显增多，其中培养至第9 h时，其生长速率达到最大；稳定期为16～26 h，菌体数不再增加，26 h时菌体的OD600值达到最大；最后在26 h后进入衰亡期，菌体数量开始下降。
图1贝莱斯芽孢杆菌SW5的生长曲线
2.3菌株SW5的生理生化特性分析
2.3.1不同环境因素对菌株SW5生长的影响
菌株SW5在不同温度下的细胞生长情况如图2。结果表明：菌株在16～50℃均可生长，温度大于16℃时，温度升高生长速度加快，最适生长温度为35℃。pH值对菌株SW5生长的影响如图3。从图3可以看出，pH值为3时细胞不可生长，pH值4～9时均可生长，最适生长pH值为5。不同NaCl质量浓度下的细胞生长情况如图4。结果表明：在质量浓度0～20 g/100 mL均可生长，0～5 g/100 mL时的生长速度呈上升趋势，5～20 g/100 mL时生长速度呈下降趋势。
2.3.2菌株SW5抗生素抗性结果分析
菌株SW5对抗生素抗性实验结果如图5。
AMP：氨苄西林，GEN：庆大霉素，KAN：卡那霉素，STR：链霉素，NEO：新霉素，TET：四环霉素，ERY：红霉素，CIP：环丙沙星，CLI：克林霉素，VAN：万古霉素，RIF：利福霉素，CHL：氯霉素，TRI：甲氧苄啶，LIN：利奈唑胺，QUI：达福普丁，PB：多黏菌素B，CTR：头孢曲松，IMI：亚胺培南，CAZ：头孢他啶。
SW5菌株对β-内酰胺类抗生素，如头孢曲松、亚胺培南，以及氯霉素表现得较为敏感；而对多粘菌素B与克林霉素则体现出较强的耐药性。张小波等[16]获得了一株鸭源贝莱斯芽孢杆菌GZZY2019，药敏实验显示该菌对红霉素、环丙沙星、复方新诺明等15种药物敏感，对丁胺卡那、哌拉西林、四环素3种药物中敏，对多粘菌素B、苯唑西林等6种药物耐药。表明贝莱斯芽孢菌株对多数抗生素表现为敏感，而对多粘菌素B等少数抗生素表现为耐药，这种特性为其在食品工业生产中的应用创造了条件与基础。
2.4菌株SW5的抑菌活性及抗菌成分分析
菌株SW5发酵上清液对几种常见病原菌的抑菌活性如何？结果表明：菌株经过MOLP培养基的发酵，其上清液对于福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌的生长均表现出一定的抑制作用。发酵上清液浓缩15倍后，对于福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌的抑菌性增强，其中弗氏柠檬酸杆菌、大肠埃希氏菌的抑菌效果变化最为显著；而对蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌来说，发酵液浓缩后抑菌性稍有减弱。整体来说，菌株SW5的发酵液对于福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌均具有较为显著的抑菌效果，SW5菌株可作为今后潜在的益生菌应用菌株[17]。
指示菌依次为1.福氏志贺氏菌，2.鼠伤寒沙门氏菌，3.枯草芽孢杆菌，4.蜡样芽胞杆菌,5.奇异变形杆菌,6.金黄色葡萄球菌，7.弗氏柠檬酸杆菌，8.大肠埃希氏菌。
为进一步探究SW5菌株MOLP培养基抗菌特性的原因，以浓缩后的发酵液样品为研究对象，通过质谱分析法检测其抗菌成分，发酵液质谱检测的总离子色谱结果。该检测条件下，峰形良好，分布相对均匀。
四极飞行时间质谱分析并结合代谢组学软件和搜库鉴定等综合分析表明：m/z 1 036.69处的吸收峰分子式为C53H93N7O13，对应表面活性素；m/z 860.42处的吸收峰分子式为C21H43N5O7，对应莫西霉素、大环内脂类抗生素；m/z 655.31处的吸收峰分子式为C34H50N4O9S，为达福普汀，属于链霉菌素类抗生素；m/z 557.27处的吸收峰分子式为C29H42O9，为山茱萸苷A；m/z 608.25处的吸收峰分子式为C22H43N5O12，为异帕米星，属于氨基糖苷类抗生素。
菌株SW5发酵液的成分检测表明：发酵液中共检测到5种不同性质的典型抗菌活性成分，印证了实验菌发酵上清液抑菌实验结果。细菌素是贝莱斯芽孢杆菌产生的优势抑菌物质，张海林等[18]纯化出了一种细菌素，分子质量约为10 kDa，能够抵抗蛋白酶K、胃蛋白酶等多种蛋白酶水解，且对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌均有较强的抑制能力。在常见细菌或放线菌产生的抗菌物质研究中已有较多报道，如在假单胞菌20#-5菌株[19]、海洋放线菌B5[20]、巨大芽孢杆菌L2[21]、枯草芽孢杆菌SB1[22]等菌株的代谢产物中找到了抑菌物质，并对它们的抑菌效果进行广泛的探索。而作为一种具有特殊蛋白酶活性多样性与较高蛋白酶活力的SW5菌株[23]，同时兼备产生多种具有抗菌活性的次级代谢产物的能力，进一步说明了贝莱斯芽孢杆菌SW5菌株具有的复杂代谢体系及存在多种酶活性，从而赋予SW5菌株多重生物学性能。SW5菌株在食品工业的进一步开发与实际应用还有待进一步的研究。
3、结论
贝莱斯芽孢杆菌SW5菌株，对数生长周期较长(12 h)，在多种培养基中均能以较快速度生长，且在16～50℃、pH值4～9、NaCl质量浓度为0～20g/100 mL可生长。SW5菌株发酵上清液对福氏志贺氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、弗氏柠檬酸杆菌和大肠埃希氏菌具有较强的抑菌作用，其发酵上清液中含有多种氨基糖苷类抗生素，如表面活性素、莫西霉素和异帕米星等，从而对多种病原菌产生抑制作用。