鲭鱼生物胺产生菌筛选、菌落总数、生长曲线测定——摘要、材料与方法
摘要：从鲭鱼体内分离7株生物胺产生菌，其中3株菌可以产生色胺，4株菌可以产生2-苯乙胺，4株菌可以产生腐胺，1株菌可以产生尸胺，3株菌可以产生组胺，1株菌可以产生酪胺。组胺生成量较高的No.1菌株形态学、生理生化分析及菌种鉴定结果表明该菌株极有可能为侵肺巴斯德氏菌，可信度为99.9%。
鲭鱼又名青花鱼，是一种常见的可食用鱼类，多见于西太平洋及大西洋海岸附近，喜群居。鲭鱼平均体长30～50 cm，寿命最长可达11年，它以浮游生物及鲟鱼、鳕鱼和鲱鱼所产鱼卵为生，属于青皮红肉鱼类。近年来先后在江苏及天津等地发现鲭鱼生物胺中毒事件。
组胺是含咪唑环化合物，在附着在鱼肉中的摩氏摩根氏菌，磷发光杆菌等微生物来源的组氨酸脱羧酶（histidine decarboxylase，HDC）的作用下，使组氨酸脱去羧基而产生组胺。游离氨基酸是生物胺产生的前体物质，水产品中游离氨基酸的量和种类对氨基酸脱羧酶的活力都会产生影响。其中组胺是引起过敏性食物中毒的最主要化学物质，是人们对海水鱼类安全问题关注的热点。
生物胺产生菌普遍存在于海水鱼的体表及活鱼的鳃和内脏中，在鱼体存活时对鱼体并不产生危害。鱼体一旦死亡，随着防御系统被破坏，生物胺产生菌在适宜温度下迅速繁殖并产生大量组胺。基于鲭鱼频繁引起生物胺特别是组胺中毒现象，本实验通过研究筛选生物胺产生菌，对分离菌的形态特征、生物胺生成情况进行分析，为鲭鱼贮藏过程中生物胺的形成及控制提供参考依据。
1、材料与方法
1.1材料、试剂与设备
1.1.1材料
冰鲜鲭鱼购于广州市海珠区下渡路水产市场，经去头、去内脏、无菌包装后于室温下（18～23℃）存放备用。
1.1.2试剂
生物胺标准品：组胺（h i s t a m i n e，H I S）（≥97%）、色胺（tryptamine，TRP）（≥98%）、2-苯乙胺（2-phenethylamine，2-PHE）（≥99.5%）、尸胺（cadaverine，CAD）（≥97%）、腐胺（putrescine，PUT）（≥99%）、亚精胺（spermidine，SPM）（≥98%）、精胺（spermine，SPD）（≥97%）、酪胺（tyramine，TYR）（≥99%）、丹磺酰氯（99%）、1,7-二氨基庚烷（98%）美国Sigma公司；乙腈、甲醇、丙酮均为色谱纯美国Burdick&Jackson公司；其他试剂均为化学纯或分析纯，购于广州粤申化学试剂厂。
1.1.3培养基
PCA培养基（1 L）：准确称取蛋白胨5.0 g、酵母浸粉2.5 g、葡萄糖1.0 g、琼脂15 g，加入1 mol/L氢氧化钠调节pH值至7.0±0.2。
生物胺筛选培养基（1 L）：准确称取蛋白胨5.0 g、酵母浸粉5.0 g、L-组氨酸18.5 g、氯化钠5.0 g、碳酸钙1.0 g、琼脂20 g和溴甲酚紫0.06 g，使用1 mol/L盐酸调pH值至5.3±0.2。
TSA培养基（1 L）：称取47 g干粉于1 L蒸馏水中加热煮沸溶解，灭菌后制成平板备用。
TSBH培养基（1 L）：准确称取TSB培养基38 g和L-组氨酸20 g，加入1 L蒸馏水，煮匀，灭菌后使用；以上培养基于1.01×105Pa高压下121℃蒸汽灭菌15 min。
1.1.4仪器与设备
TU-1990紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；3K30型冷冻离心机美国Sigma公司；388型立式蒸汽压力灭菌锅上海申安医疗器械厂；Agilent 1100高效液相色谱仪美国Agilent公司；WGP-350隔水式电热恒温培养箱上海华岩仪器设备有限公司。
1.2方法
1.2.1菌落总数的测定
参考卢涵等的方法测定菌落总数。取常温贮藏0、1、2、3、4、5 d的鲭鱼背部肌肉组织，无菌条件下捣碎混匀，称取10 g置于装有90 mL生理盐水的锥形瓶中（内含灭菌玻璃珠），混匀。用无菌生理盐水依次稀释成10倍系列稀释样品匀液，无菌条件下进行PCA培养基平板稀释实验。
1.2.2菌株的分离与纯化
参考杨健等的方法，将上述样品稀释液在无菌条件下在生物胺筛选培养基上进行平板涂布实验，然后将涂布后的培养基置于35℃的恒温培养箱中培养3 d，肉眼观察生物胺筛选培养基上的菌落，蓝紫色菌落即为生物胺产生菌。用接种环将培养基中的蓝紫色菌落接种于TSA培养基中纯化培养，35℃培养2 d。
1.2.3菌株生长状况及生物胺生成情况
将纯化后的细菌接种于TSBH培养基中，分别置于4℃和35℃环境中振荡培养2 d，用紫外分光光度计连续测定培养液的OD605 nm值，表示各细菌的生物量。参考杨贤庆等的方法，取1 mL 35℃条件下培养48 h的发酵液，采用柱前衍生高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对组胺（HIS）、色胺（TRP）、2-苯乙胺（2-PHE）、腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、酪胺（TYR）、亚精胺（SPD）和精胺（SPM）8种生物胺进行测定分析，实验重复3次。
色谱测定参数：色谱柱：Grace Smart RP-18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱温40℃，流速1.0 mL/min，进样量10μL，荧光激发波长为350 nm，发射波长为520 nm。流动相A为0.1 mol/L乙酸铵溶液，流动相B为乙腈，流动相C为超纯水。梯度洗脱程序见表1。
表1梯度洗脱程序表
1.2.4生化实验
1.2.4.1菌落形态及色泽观察
观察并描述单菌落在平板上的形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度、菌落及培养基的颜色等菌落特征。
1.2.4.2革兰氏染色
挑取菌落，进行革兰氏染色实验，用显微镜观察菌体的革兰氏染色情况。
1.2.4.3菌种鉴定
挑取单菌落分别接种于3 mL质量分数0.45%无菌NaCl溶液（pH 4.5～7.0）中，混匀，配制相当于0.80～0.10麦氏单位的菌悬液，使用丹麦Biosense微生物生长动态监测系统进行菌种鉴定。
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